fí/HME TOD WA ♦ SPEKTROFOTOMETRIE / TURBIDIMETR FLUORIMETRIE / LUMINOMETRIE ♦ STANOVENÍ ENZYMOVÝCH AKTIVIT - stanovení hladin enzymů; - vizualizace proteinů a NA na gelech ♦ IMUNOHISTOCHEMICKÉ BARVENÍ - proteiny, nukleové kyseliny; - barvení organel; morfologie buněk ♦ DALŠÍ INTRACELULÁRNÍ EFEKTY - stanovení koncentrace Ca2+, thiolových skupin (GSH, proteiny); membránový potenciál, pH; ilita / prolifer Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně kifíi\/7Ť= ♦ Absorpční spektrum: spektrum vnějšího záření je ochuzeno o frekvence (vln. délky), které odpovídaj rozdílům energií buzených atomů (např. žlutá barv látky odpovídá absorpčnímu pásu 435-480 nm, červená 490-500 nm, modrá 580-595 nm) ♦ Energii molekuly lze vyjádřit součtem energie elektronové, energie vibrační a energie rotační (E = Eel + Evib + Erot): - UV + VIS (absorpce - excitace valenčních elektronů), event, absorpce a emise (luminiscence); - IR absorpce - excitace rotač. a vibr. stavů molekuly IR absorpční spektrum); - mikrovlny - excitace rotac. stavu molekuly (mikrovlnná abs. spektra) a excitace neparových elektronů v magn. poli (paramagnetická resonanční spektra) - radiovlny - excitace atomových jader (NMR spektra) Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně kifíi\/7Ť= FLUORIMETRICKA DETEKCE 366 514 568 647 442 460 1 546 633 1 300 400 SOO 600 Wavelength (nm) 700 ABSORPTION FLUORESCENCE R-Phycoerythnn (pH 7} Alexa Ffuor 647 (pH 7) Alexa Fluor 660 (pH 7) DiJC,,(3) (MeOH) Rhodamine Red-X (MeOH) Alexa Fluor 660 (pH 7) AJexa Fluor 546 (pH 7) Texas Red (pH 7) YOYO-1 + DNA {pH 7) Tet ramethy I rhodamine (MeOH) Alexa Fluor 594 (pH 7) BOOIPV FL (MeOH) Alexa Fluor 466 (pH 7) Fluorescein (pH 9) BODIPYTR (MeOH) BODIPYTMR(MeOH) Carboxy SNARF-1 (pH 10) F M 1 -43 + Ltpid Fura-2 *■ Ca=- (pH 7) lndo-1 +CaJ- (pH 7) Cascade Blue (pH 7) NBD (MeOH) DAPI t DNA {pH 7) Alexa Fluor 350 (pH 7) AminomeihylcoLimaiin (MeOH) Lucifer yellow (pH 7) Propidium iodide + DNA (pH 7) Dansylamide {MeOH) ■ enzymové aktivity (fluorogenní substrát) - histochemická detekc - koncentrace látek (Ca2+, DNA, NH2-, SH-) ■ membránový potencií - fluidita membrán -derivatizace analytů pro detekci v H PLC Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně li(iíl\/Žr= príklad excitačního a emisního spektr metrických činid L^U^/l C o X CD CD u c o o to o Excitation spectrum ex i Emission EM t spectrum EX 3 Wavelength c g co co "e (D CD O C CD U CD i— O Příklad užití: exc. a emisní spektrum resorufinu SSO 100 -150 Í0Ů 5JÜ 61» 550 7K> irtŕa^lortgth (nm) Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně kifíi\/7Ť= SUBSTRÁTY ENZYMOVÝCH REAKC PŘÍKLAD STANOVENÍ BIOMARKERŮ OX. STRESU HAH HAH-AhR-hsp90 ARNT AhR Ahq oncogene activation hspGO ¥-OH EH HAH-AhR-ARNT ffRE] t etectroptíiles \f 1 | HSF MRF J ; ^á I j ----; ŕ t J -I J » ARE± i HSREi MRE i P«0 \apo-P450 GS-, l-- -.. , %* ^ / GST a-gi-vre \ 02 X SQ ľhSp_ MT ' / HQ * ®" (hÄhT^ Ql PPIX g]y + succCqA + ľÄLÄTI ALA O t PBG t Uro'geri •©í o + Gopnďgen + Protogen Fs Biotransformační enzymy Antioxidanty (enzymy a nízkomol. látky - GSH) Produkce ROS Produkty oxid. stresu (lipidní peroxidace) Zánětlivé procesy (LOX, COX, cytokiny aj Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně kifíi\/7Ť= SUBSTRÁTY ENZYMOVÝCH REAK CYP1A1/1A2/1B1 (Ethyl-, Methyl-), CYP2B/3A (Pentyl-, Benzyl-) s pektrofluori metrická detekce resorufinu (exc. 530-570, em. 585 nm) Alkylresorufins (alkoxyphenoxazones) Stanovení aktivit CYP enzymů založené na chemiluminiscenční detekci luciferinu 40Í1QOO 350000 RLU 20WOO- 1D00ÜO- Uicfferin-H L^dfe™ COOH COOH h «UXÍUO'-'-QUÍíí-íi-ltnľ)'-'' ci-'-^ftjiľHCM«LKJryCMnfíricyí - ^ S rír *- * TU" 1300000-, LucffBfin-BE LiKŕíarin 50ÖD00^COOH COOH 5000DO-T N RLU 300DQO- 100000 !«ra i f-r _ OH T i t i i r r i i-m- ■g *- f* t; * í "if c CH2CH2CNH{CH2)3CNH ~CH NHCCH, O li NHCCH. CH^O-CCH» c li J CH REAKCI STANOVENI EXPRESE (AKTIVITY) REPORTEROVEHO GENU LUCIFERAZY HO^V/ \ yY00H Luciferase 'W\ / V°" //-------( + ATP + Os---------> />-------\ + ATP + PP,+ C02 + Luciferin Oxyluciferin Light Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně kifíi\/7Ť= lKTIVITA REPORTEROVEHO GENU - LUCIFERAZY INDIKUJI EGErrOTíU a e JLLi^L uciferin + ATP -► xvluciferin + ADP + hv ^LightS- HSP9Í JISP9Í Nuclear Factor mm* ARNT DRE-Luc "Activated" \ / Increased Protein\ Modulation of Gene Phosphorylation xx Expression Membrane Proteins Cytosohc , Proteins/ Luciferase Adapted from Blankenship (1994) Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně kifíi\/7Ť= MUZEME STANOVIT EXPRE říklad - stanovení transaktivace AhR: - exprese reporteroveho genu, chemiluminisceční stanovení luciferázové aktivity (DR-CALUX) - stanovení exprese CYP1A1 mRNA (RT-PCR) -stanovení hladiny proteinu CYP1A1 (Western blot) - stanovení enzymové aktivity CYP1A1 (EROD) Z-DEVD-N ^^s^S >řN v^ C00H w-v Caspase-3/7 H^N DEVD- + XXXr N, S COOH STANOVENI AKTIVITY ENZYMU APOPTO H Z-LEHD-N^\^S. yy JtL ^COOH Z-LETD-N ^^\/ ^S Caspase-8 oř 9 «r. H!Nxx;k^C00H Z-LETD N ö + ATP + 0: Dihydrorhodamine 123 difunduje přes buněčné membrány a je oxidován na fluorrescenční Rhodamine 123 KCERO O II CH3-C-0 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (dichrorofluoresc ndiacetát) je po vstupu do buňky podroben esterázové reakci; detekuje ROS včetně NO (H202, superoxi peroxyl HOO) 10 lékařství v Brně kifíi\/7Ť= NH NH Luminol d»r m ^ (N03~>2 Dimethylbisacridinium Nitrate (Lucigenin) STANOVENI KONCENTRACE PROTEINU spektrofotometricky (absorbance 280 nm); různá činidla selektivní na aminokyselinové zbytky, nejužívanější je stanovení pomocí kyseliny bicinchoninove (bicinchoninic acid, BCA): Primární substrát: CuS04.5H20; Cu(ll) je proteiny redukován na Cu(l) a ten je detekován pomocí BCA; fotometrické stanovení, i v 96-jamkových destičkách; kalibrace na BSA; nízká citlivost metody na přítomnost detergentů O C-ONa Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně kifíi\/7Ť= ONCENTRA 300 i^ciy3ooHir hVůHOOůfll, 320 340 360 380 400 120 f 100 □ Š eo E li.i 40 | 20 300 í: Ci-i.■:,-(,■■; 320 halation Wavelength (nm) FURA-2/AM o I —T^----------1------------------1------------------1-----------------1 340 360 330 400 Calcium-sensitivní chemická sonda (zvyšující se koncentrace Ca2+ zvyšuje fluorescenci při excitaci 340 nm; detekce 510 nm) Fura-2/AM (acetoxymethylester) má nízkou fluorescenci; po vstupu do buňky je hyd roly zován esterázami n Fura-2) Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně kifíi\/7Ť= závislost na pH * červený agregát JC-1 480 500 "^520 ' 540 560 ' 580 ' 600 Wavelength (nm) ECL Plus Western Blottin I— 1 <~.l -Al Peroxide + HRP, buffer Peroxide. Light +s]C3 fjJjJJLJ líJIC, 430, N* I CH3 (excited product) I CH3 (Acridinium ester) H + CO2 Fotometrická detekce lipidní peroxidace pomocí kyseliny thiobarbiturové (detekuje hydroperoxidy lipidů) Stanovení aktivity NADPH oxidáz a „konzumace" NADPH v buňkách (snížení absorpce při 340 nm) Stanovení cytotoxicity, viability, proliferace buněk - MTT (methylthiazoltetrazoliumbromid) se v mitochondriích přeměňuje na barevný nerozpustný formazan (pro kvantitativní stanovení je rozpuštěn po inkubaci buněk s SDS) - XTT produkuje rozpustnou formu formazanu (opět fotometrická detekce - Neutrální červeň - příjem do buněk - Kombinace calcein AM (fluorogenní esterázový substrát -zelený produkt) + ethidium homodimer-1 (ten vstupuje jen do mrtvých buněk a barví NA červeně) ♦ Další informace např. v užitečném katalogu firm M CT WH 11 ei m ZA M >I4d V/kWÍŘ >1 M >I4^M#] í ill Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně kifíi\/7Ť=