IDY: FU
LACE. SE
ACE
♦ FOSFOLIPIDY
chemické složení a funkce v buněčných membránách; metody stanovení fosfolipidů
fosfolipázy - produkty reakcí (ceramid, DAG = 2nd messengers) a stanovení enzymových aktivit lipái
♦ MASTNÉ KYSELINY
chemické struktury mastných k      "
mastne kyseliny - 2nd messengers a prekursory dalších lipidních signálních molekul
stanovení aktivity LOX, COX, CYP
♦ POUŽITÍ INHIBITORŮ SIGNÁLNÍ TRANSDUKCE
PLA2, PI-PLC, PC-PLC, DAG-lipáza;
inhibitory LOX, COX, CYP
Fosfolipidové membrá
□
čwo\ňé
molrhyJa hpidu
mciiakuij pŕ««ifltŕ
PLD
OLOrP-0
á   h j _
O PLC
-R
GLYCEROLFOSFOLIPID
Ptdlns
PtdlnsP
PL-C   \   fast
InsP
e
i
Ca
2+
	Ptd cholin   [		
chol	i ne +^s       PL-D slow   ™		
		Ptd	
DAG
r KC
/1\   /1\
arachídonic acid
i
prostaglandins and others
Fosfatidylinositol-specifická fosfolipáza < a fosfolipáza D (reakce fosfatidylcholin-specifické fosfolipázy C není znázorněna)
Co stanovujeme:
- složení fosfolipidů;
- hladiny DAG, ceramidu.
- produkci mastných kys. a metabolitů mastných kys. (AA, prostaglandini leukotrienů aj.)
Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně
IHdlJM«]*
SFOLIP
Funkce DAG: (aktivace PKC, proliferační signály aj.)
o
n
Pfcospliíiiiŕlylcliolínc
iJVJsyrjiißsi
ÍC tram jde)
Různé funkce csramidu v různých typech buněk (aktivace PK, íD^hilírz, 3JpppioiJc]<ě akimiJy)
CHjOH
HjOP03-CHjCH2^+(cjí^í
Sphingomyelin
STANOVENI FOSFOLIPIDU
HPTLC:
Fosfolipidy odvozené od glycerolu - skupinová analýza; Sfingomyeliny - skupinová analýza; Izolace skupiny pro další analýzu (LC/MS)
LC/MS:
Stanovení jednotlivých fosfolipidů
-    analýza celého vzorku (lyzátu buněk, liposomů apod.);
-    izolace HPTLC - analýza LC/MS;
-    separace skupin na kolonce SPE - analýza LC/MS
Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně
kifíi\/7Ť=
LC STANOVENI FOSFOLIPIDU A LIPIDOVYCH METABOLIT!
								
	i íniw	S-ih cťil S(*1l-iii1 kí>						
		l	1	í	1	P	t	
	Triŕl>vrJnfc>					Hh.TII	■	
	Fiůc- Fjlľi Aiul					II.-. 1	04(	
	EJiĽlv.enis 1.:					i! Ty	" :i	
	DiplvL-crKHs l.í						OJJ	
	^^*^l>LTcriiJe>							
	PlKi-.[rfiiliil>lr1luJiiilHniiiic	0.T1	(ií.í		0 4.1			
	Pnnh|lhálaJhliMiiniilYlcltyli:lliuinliiminErl	1)71	(1.41		DUJ			
	L'üiüioCipin		tlSt-	IVLHH				
	Wni*p1ulii>tebji*rnl	U.M>	0.50	1131	0»			
	E**v^Ji:r;iik-| iPimrlhyktblIVibniiir)	KB	■ 1  !.-.		Ů?T			
	F^WX^i* hIÍl- Al-kJ	tiífl	ÍIÍĽ-	I11H				
	Hm d phj i lily y>»Mn 1	UJÍ	(J.]U					
	MtiruptiuidSi-lchnlinď	li.U	.....		iM"			
	Flui ph m id filtri ne	IÍ..1.1	0.13					
	CVnrNrríido	l>14	(i H					
	OffwnUtd	J»	ir					
	^Mqfata	lř.:H						
	SphinRDm^tifl	iy;s	í.ij.					
	L/Hi-P1»y*pluliiJ>lirlj(Tcrci|	O.SJ	ojn					
	l.yui-PtKrf^tiiliilylrlhjiHilMmi*;	IHÍ	■:i?i					
	MtEriVfl^wHoU^v	inrl	(1.14					
	L(lo-Hlütn4iacidk Aíld	IhJU	ÚJU]					
	JYiTj iľwéi'i Jiil|iin	IK.1J	(J.U					
	l ^i»-PH<nphJli<ll |i»vjtíil	n.;u	oni					
	1 ^i:-IMii|L|ilulHjtli:hiiliiiř	iki:	(ICH.					
	Lj ■*£>■ Pli na [in utylnť r i ne	IKIH	Utll					
	rr-sdl*trt hnuli. SOI.VFM SYSTEMS						U  r-1 j	
	dfcniírcm: Mnfamil : Ammnnium Hfdreuiide................. Chkcnrccni: Hnané: Mcihuiol : Acťiic Acid   ...................			....................»			: » : HO - ä «G: Hl: ID	
							..... J :2    "	
	Tiiliircr : [lllimluťlii . Mrtluniil   ...........                    .........						KJ: 11:J	
Proč stanovujeme fosfolipidy:
- složení buněčných membrán
- složení fosfolipidu v liposomech
- kontrola čistoty izolovaných fosfolipidu
- stanovení enzymových aktivit (PLA2J PI-PLC, PC-PLC, PLD)
Příklad stanovení PC-PLC:
- buňky značeny [14C] cholinem a [3H] kyselinou myristovou (inkorporace do PC)
- extrakce lipidů (CHCI3:MeOH)
- separace TLC
- spray s barvičkou (primulin)
- separace TLC v 2. mobilní fázi
Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně
kifíl\/7r=
PHOSPHOLIPIDOMICS" (HPTLC)
PE
PS
•
L-PE
L-PS
PC
SM
L-PC
Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně
kifíi\/7Ť=
	CHOL				L					
	■					p-p	E			
							d-PE			
	300   -									
0)	.									
t/i										
c	<									
o	H							PC		
(/i								i		
Q)										
>—										
i__	■t									
£										
									i	
O										
0	■		CER-1							
"S	-		'							
Q	100   -								SM-2	
			CER					PS                        SM		
			Hil			s	PI	a?   JU		
	J-Ji		i   ■ W \     i		-----f         ■     "* 10	20		-------w-----------i              f-----■-----*-----------■-----     -^              p              1              ■              ' 30                              40		50
								Tíme {min)		
Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně
kifíi\/7Ť=
NOVENI FOSFOLIPIDU
PE
vV
\Jv^
I-----------------I—
0           16
min
PC
yuAsJ«^
3
U
u
16
32
4
6
48
—r-64
min
Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně
STANOVENÍ CER
Jffllc;
Track   1  . ID: PC
Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně
CH^CH^ 2CH = CHCHOH (CH2)4-C-NHCH
O i ■
CH20-P- OCH2CH2N(CH3)3
BODIPY FL (^-sphingomyelin,
GH3(CH2>12CH = CHCHOH
(CHJ,-C-NHCH ^ ^     n            l
O          CH2OH
BODIPY FL C5-ceramide.
CH3ÍCH2)12CH =CHCHOH NH<CH2)5- C -NHCH .J\^N        O          CH   OH
NCU
NBD C6-ceramide.
Quenched substrate (bis~BQDIPYFLCirPC)
o
(CH>}irC-OCH2
210 li*  I        II                  +
0\   CH^-P-OCH^CHjNtCH^g ď
—■ Ptiospholipäse ŕ,
o
II
H3C       F        F        (CH^g-C-OCK,
HOCH       O
CH^P-OCHjCHgWCHgk
Fluorescent lysophosphalipid             ó
-f
o
Fluorescent fatty acid (BODIPY FL C1n (D-3362))
(ES
H.c     f
Quenched substrate (PED6)
o
ii
c-H3rcK£)—c-och^
a 4       II *    I                   L|
*4-
o"
—■ PhosphoíípasĚ Aa
0£N
h—ľ     y— nq2
o
l!
02N
CHaŕCH^-5-C-OCKj
HOCH       O                        O                   C \—s
CH^-P-OCH^HjHH-í-tCH^NH—ŕ     V-
MO.-,
I 0
Wonfluorescent íysophosphoíipjd

Fluorescent fatty acid (BODIPY FL C5 (D-3934))
ího lékařství v Brně
kifíi\/7Ť=
STANOVE
TIVITY PI-PLC POMOCI WESTERN BLOTU
♦  Stimulace buněk, lyže
♦  Imunoprecipitace (protilátka proti PI-PLC + protein A-Seph                   mmmmmĚmmmammm     mmr
♦  PAGE a transfer proteinů na membránu
♦  Protilátka proti PI-PLC nebo proti fosforylované tyrosinu (detekce aktivované formy enzymu)
♦  Vizualizace proteinu (ECL*
Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně
kifíi\/7Ť=
fosfolipasa A2
lysofosfolipid + rachidonová ky
YSELI
fosfatidy I inositol
fosfolipasa C
fosfoinositol
1,2-diacylglycerol-------
diacylgiycerolj              diacylglyccmllipasa
kinasa            I
fosfatidová                     monoacylglycerul
kyselina                                     +
fosfolipasa AJ
arachidonová kyseľu
lysofosfatidová kyselina
+ arachidonová kyselina
Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně
kifíi\/7Ť=
NASYCENÉ MASTNE KYSELINY:
- máselná (4:0)
- laurová (12:0)
- myristová (14:0)
- palmitová (16:0) -stearová (16:0)
METODA STANOVENI:
HPLC, fluorimetrická derivatizace HPLC / radiometrická nebo refraktometrická detekce GC po derivatizaci (methylaci)
NENASYCENÉ MASTNÉ KYSELINY:
olejová (18:1)
linolová (18:2, příklad n-6 kyseliny)
linolenová (18:3)
arachidonová (20:4)
eikosapentaenová (20:5)
dokosahexaenová (22:6)
HPLC / fluorimetrická detekce nebo HRGC/MS
Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně
kifíi\/7Ť=
Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně
kifíi\/7Ť=
HPLC analýza karboxylových kyselin po derivatizaci PDAM (fluor, detekce)
SO, 00
Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně
kifíi\/7Ť=
6    5
COOH
20
11   12
Lipoxygenases
Arachidonic acid
P450S
Cyclooxygenase
LT	EETs	PGs
HPETEs	HETEs	TxA2
HETEs	tú alcohols	PGI2
Llpoxlns	o>1 alcohols	
Hepoxilins		
YSELINY (CYP ENZYMY ZODPOVEDNE ZA >XYGENÁZOVÝ METABOLISMUS)
5.6-DlHETE
Detekce a kvantifikace metabolitů pomocí HPL nebo GC/MS
14.15-EET
"   » I.IZ-DKETE
cc
w
i 4,1 5-DiHETE
4rt_nu   11                                      i rt     rtu    «a    W
20-OH A A
I9-OH AA
cyklooxygenasov á
aktivita (inhíbiůfc aspirinem)
CGOH
COOH
204
cykuznjídí
dráha
COX
iiruchidonová kysuiinu
LOX
linťarizujjcí
ÜO í [
5-hydri)pcrriÄ>-Íko?>utĽlruĽn-k ysclí na
ilcbu
l!ľ>, ,
12 -li yd ri ipvTtj xy -i kusatctruťn -kyselinu
nebi) HOC)
IS-liydropLrinujr-ilíiiSatetriníii-kyselihu
, COOH
■**   IcukútriĽny
-COOH
,C0OH
h ydroiwrosid asoT á aktivita
Stanovení aktivit COX a LOX: GC/MS nebo HPLC metabolitů AA
STRATEGIE DETEKCE KLIČ DRAH MECHANISMŮ TOXIC
SIGNÁLNI
lEaJElLEiriK
EXPOZICE TESTOVANÝMI LATKAMI
SPECIFICKÉ INHIBITORY
AKTIVACE ENZYMU
Specifické inhibitory CYP, COX, LOX, PLA2, PI-PLC, PC-PLC, a MAPK; antioxidanty
MODULACE SIGNÁLNI TRANSDUKCE A GEN.EXPRESE
MODULACE BUN.
CYKLU, PROLIFERACE,
MEZIBUNĚČNÝCH
SPOJENÍ
Vvzkumnv ústav veterinárního lékařství v Brně
kifíi\/7Ť=