Jméno: Hana Mlčochová Skupina: Stř 15-17 Obor: Molekulání biologie a genetika Počet stan: 4 Strana: 1 11 Vitální test - Pozorování živých a mrtvých buněk kvasinek Úvod: Vitální test má v praxi značný význam při kontrole mikroorganismů během technologického procesu. Sledujeme jejich odpověď (změnu počtu) na přídavek či úbytek různých látek či na fyzikální proces. Buňky použité ve cvičení patří mezi eukaryontní kvasinkové organismy. Rozlišení mrtvých buněk: Ø nepřímé - kultivační test – počítáme CFU plotnovou metodou, zdlouhavé, ale přesné Ø přímé – test vitality (okamžitý stav populace) Test je založen na propustnosti membrány mrtvých buněk: cytoplazmatická membrána u mrtvých buněk není semipermeabilní, barvivo se dostává dovnitř. Živé buňky barvivo nepropustí nebo jej odbourají. K barvení se využívá netoxických barviv. Roztok methylenové modři je zředěný a pufrovaný fosfátem, pH = 4,6. Počet buněk stanovujeme např. v B. komůrce, což je skleněná destička podložního skla s počítací mřížkou. Prostor mezi podložním a krycím sklíčkem má u různých komůrek různou hloubku (např. 0,1mm) a je na komůrce vždy vyznačen. Plocha čtverečku je 0,0025 mm^2. Při hloubce komůrky 0,1mm je objem nad každým čtverečkem 0,00025 mm^3, čili 1:4000 mm^3. Materiál: - Erlenmeyerova baňka - Zkumavky - Pipety, kapátko - Krycí a podložní sklíčko - Sterilní destilovaná voda - Vodní lázeň, teploměr - Zásobní kvasinková kultura - Mikroskop - Bürkerova komůrka - Methylenová modř - Filtrační papír Postup: Ø Připravíme si suspenzi kvasinkových buněk z pekařského droždí: 0.5 ml zásobní kultury kvasinek napipetujeme do 5 ml sterilní destilované vody v Erlenmeyerově baňce Ø Z ní pipetujeme po 1 ml suspenze do každé ze 4 zkumavek Ø První zkumavka se bude zpracovávat jako startovní vzorek pro zjištění počtu živých buněk při pokojové teplotě při začátku pokusu Ø Ostatní zkumavky umístíme do horké vodní lázně (60°C) Ø Druhá zkumavka je vytažena po 5 minutách Ø Zchladíme studenou vodou Ø Třetí po 10ti a poslední po 15ti minutách Ø Stanovíme počet živých a mrtvých buněk v jednotlivých zkumavkách a to tak, že do prohlubně Bürkerovy komůrky naneseme kapku suspenze a zakryjeme krycím sklem. K okraji krycího sklíčka přikápneme methylenovou modří, na opačné straně ji odsajeme filtračním papírem, až je celý preparát zbarven modře. Ø P 2 až 5ti minutách se buňky usadí a mrtvé jsou obarveny modře Ø Pozorujeme pod mikroskopem při vhodném zvětšení max. 40x10 Ø Počítáme živé nezbarvené buňky a mrtvé namodralé buňky v deseti čtverečcích Ø Buňky ležící na levé a spodní straně do počtu zahrnujeme, na pravé a horní straně ne Ø Postup opakujeme pro suspenze kvasinek v jednotlivývh časových intervalech pro každou zkumavku Ø Zjistíme tak narůstající počet mrtvých nabarvených buněk Ø Počet buněk musíme stanovit pro 1 mm^3 a z toho následně pro 1 ml!! Ø Stanovíme koncentraci buněk v Erlenmeyerově baňce a sestrojíme graf závislost přežívajících kvasinkových buněk na délce doby vystavení zvýšené teplotě Nákres: čtvereček Bürknerovy komůrky, rozdělený na další, s jednotlivými údaji dopočtu do 1mm: Vyhodnocení: 1) Tabulka 0 minut 5 minut 10 minut 15 minut * * * * 1 160 20 86 7 68 33 33 26 2 107 9 69 11 81 22 24 23 3 117 10 107 10 58 25 35 14 4 112 21 126 13 49 14 39 25 5 120 18 114 12 44 21 46 34 6 136 11 83 17 57 16 28 31 7 164 16 105 18 38 23 20 32 8 175 18 137 20 49 23 20 33 9 160 18 97 8 64 27 25 39 10 135 15 118 19 32 22 19 32 Celkový součet 1386 156 1042 135 540 226 289 289 Procenta 89,9% 10,1% 88,5% 11,5% 70,5% 29,5% 50% 50% Souhrn: Čas (min) Počet živých b. V 10ti čtvercích Počet mrtvých b. V 10ti čtvercích Celkový počet b. v 10ti čtvercích Procento přežívajících buněk Procento mrtvých buněk 0 1386 156 1542 89,9% 10,1% 5 1042 135 1177 88,5% 11,5% 10 540 226 766 70,5% 29,5% 15 289 289 578 50% 50% 2) Výpočet celkového počtu buněk v 1 ml: N v 1 ml: součet buněk živých a mrtvých / 10 x 250 x 1000 0 minut 5 minut 10 minut 15 minut N (celkový počet buněk v 1 ml) 38 550 000 29 425 000 19 150 000 14 450 000 3) Vitální test Graf závislosti počtu přežívajících (či naopak mrtvých) kvasinkových buněk na době jejich vystavení zvýšené teplotě - osa y: čas (minuty) - osa x: % přežívajících (mrtvých) buněk - pro každé číslo N v každém čase je potřeba sečíst počty živých (nebo mrtvých) buněk – kolik tvoří % z celkového počtu - vypočítáme tak pro všechny časové intervaly. Graf: závislosti počtu přežívajících (mrtvých) kvasinkových buněk na době jejich vystavení zvýšené teplotě (60°C, intervaly 0, 5, 10 a 15 minut): Závěr: Docházelo k plynulému úbytku buněk. Živé a mrtvé buňky byly dobře rozeznatelné díky jejich schopnosti přijímat barvivo.