Úvod do identifikace bakterií Základní biochemické testy Průvodce po cvičení Identifikační testy • Zkumavkové • Mikrotesty – v 1 soupravě je 10-20 biochem. testů ENTEROtest, STAPHYtest, ANAEROtest , STREPTOtest , NEFERMtest……. • Hodnocení: identifikační tabulky TNW program – identifikační skóre (%); T index 0-1 Dostanete neznámý vzorek…… • Může být izolátem z prostředí nebo naopak součást mikroflory teplokrevných živočichů • Cílovou skupinou našeho cvičení jsou fermentující enterobakterie s fakultativně anaerobním metabolismem (obyvatelé střeva) • Odliší se od nefermentujících G- tyček z prostředí několika jednoduchými testy: KAT +, OX -, OF-test: fermentace glukózy + Enterobacteriaceae • 65 druhů - gramnegativních tyčinek • Proč fakultativně anaerobní druhy – co je akceptor e^- ? • Trávicí trakt • Přítomnost ve vodě: ukazuje na fekální znečistění • Většinou nepatogenní • Patogenní jsou některé druhy: Střevní infekce: Salmonella, Shigella a Yersinia Celkové infekce: Yersinia pestis (původce moru) a tzv. antropopatogenní serovary salmonel (serovary Typhi, Paratyphi A, Paratyphi B a Paratyphi C) a některé kmeny E. coli (EPEC, ETEC…) My jsme je již pozorovali… • Koliformní druhy na Endově agaru, při rozboru vody: • mFC medium 44°C – červené kolonie (štěpící laktózu –modré – fekální koliformní, E. coli) Pokud vzorek odebíráme z těchto selektivních medií, můžeme provést rovnou ENTEROtest Postupy ve cvičení: • Pokud máme vzorek na neselektivním mediu, tedy náš případ, provedeme 2 sklíčkové pokusy: 1) musíme nejprve určit G- typ buněčné stěny (enterobakterie jsou G-) 2) Enterobakterie jsou nadány schopností likvidovat peroxid vodíku – kataláza pozitivní buňky této čeledi pod jeho tíhou šumí • Následovat budou demonstrační zkumavkové testy, u nichž odečteme výsledky a určíme, které neznámé vzorky fermentují. K tomu poslouží 1) OF test (oxidace-fermentace glukózy) 2) TSI test (triple sugar, iron) • U fermentujících buněk provedeme ENTEROtest se standardním zákalem buněk • a test na oxidázu – enterob.negativní (OXI test) • a test produkce β-galaktosidázy štěpící laktózu (ONPG test) G- vs. G+ • Můžeme provést Gramovo barvení, tím mimo jiné zjistíme i morfologii buňky či morfologii shluků buněk, což jsou další důl.identifikační znaky, které urychlí rozhodování pro další testy • G-/G+ však určí i rychlejší KOH test 1)KOH test • Na ožíhnuté sklíčko kápneme 3% KOH, v místě kapky lehce rozmícháme vyžíhanou kličku s odebraným neznámým vzorkem • G- buňky mají slabou buněčnou stěnu, která rychle uvolní obsah buňky a za kličkou se táhne viskózní suspenze: 2)Katalázový test • Rozklad peroxidu vodíku na vodu a kyslík je katalyzován enzymem katalasou. • Přidáme 3% peroxid vodíku k bakteriální kultuře přímo na mediu nebo na nátěr buněk na sklíčku. Pozitivní test se projeví uvolňováním bublinek kyslíku. • Uvnitř velké skupiny G- bakterií můžeme bakterie dále dělit na bakterie fermentující (fakultativně anaerobní metabolismus, který glukózu oxiduje i fermentuje, jako např. naše cílová skupina enterobakterií) a bakterie s výhodnějším respiračním metabolismem - nefermentující aerobní vibria, aeromonády, pseudomonády… • Takové testy pro vzájemné odlišení enterobakterií od Vibrií, aeromonád spočívají v jednoduchých reakcích: test oxidázový, fermentační (OF test)... • Vibria a aeromonády také štěpí glukózu, ale jsou vždy oxidáza pozitivní – glukózu tedy nefermentují, jsou nefermentující • Další skupiny gramnegativních nefermentujících baktérií (mohou to být tyčinky, ale i kokotyčinky či koky) nikdy neštěpí glukózu. Oxidázu mohou mít pozitivní i negativní Ve cvičení dále následují dva demonstrační pokus, u kterých odečteme fermentaci glukózy a u druhého využití dalších cukrů Tedy: 1) OF test a 2) TSI test 3) OF test test na oxidaci (aerobní metabol.)/ /fermentaci (anaerobní met.) • = detekce respiračních enzymů • používá se medium s glukózou a acidobazickým indikátorem bromthiolovou modří, která je následně ve vzniklém kyselém prostředí žlutá, v zásaditém modrá alkalizací a při neutrální reakci zelená OF test - odečet • Pozitivní reakce oxidace či fermentace GLUKÓZY se projeví žlutým zbarvením • Pokud již tedy víme, že pracujeme s G- buňkou, která je navíc kataláza pozitivní a pod parafínem v OF testu měla pozitivní žlutou reakci, bude to tedy fermentující enterobakterie. • V OF testu možno odečíst i pohyb buněk – pohyblivé druhy tvoří „oblak“ kolem vpichu • Zkusíme dále využití tří cukrů – ten dále rozdělí enterobakterie do menších skupin a otestujeme produkci sirovodíku a plynu v tzv TSI testu. 4) TSI test (tripple-sugar iron) • Test na utilizaci tří cukrů – glukózy, laktózy a sacharózy + testování produkce H[2]S a plynu • acidobazický indikátor je bromkrezolová červeň • - indikátor produkce H2S je železo Hodnocení TSI • Sledujeme štěpení glukózy nebo laktózy; plyn • Některé bakterie uvolňují sirovodík z aminokyselin obsahujících síru (cystin, cystein, methionin). Produkce je detekována pomocí síranu železnatého (vytváří se černý sulfid železnatý). Další příklady růstu na TSI: Pro zkvašování cukrů platí následující pravidla: pokud kultura nekvasí glukosu, nekvasí ani jiný cukr. Kultura fermentující glukosu fermentuje i fruktosu a manosu. Fermentuje-li laktosu, nefermentuje maltosu a naopak. 5) Enterotest 16 • pro další identifikaci fermentujících • jamkové testy • Nesmí dojít ke kontaminaci sousedních jamek • Testy se při kultivaci uloží do sáčku aby nevysychaly • ENTEROtest kultivujeme při 37°C/16-4°h • Do zbytku suspenze ve zkumavce sterilně pinzetou namočíme (ožíhnutí hrdla zkumavky) test na oxidázu, papírek vytáhneme • Poté do zkumavky vložíme papírek ONPG testu a po ožíhnutí hrdla dáme kultivovat spolu s ENTEROtestem • OXI test – enterobakterie jej mají negativní Pozitivní OXI test má tmavě modrou barvu a to do 30 sekund. Do dvou minut zmodrá opožděně pozitivní reakce. Šedá či nazelenalá barva po dvou minutách znamená reakci negativní. • Pozitivní ONPG reakce je po 4hodinách kultivace žluté zbarvení. Jedná se o test na produkci enzymu betagalaktosidázy, který štěpí laktózu (poznáme již v TSI) Hodnocení • Získané údaje jsou zpracovávány podle klíčů a tabulek, často za pomoci počítače. Protože identifikace je značně náročná, podaří se jen málo typických vzorků zařadit až do druhu přímo v provozních laboratořích. Protože se vyskytují mutanty a jejich procento stoupá v souvislosti se vzrůstajícím znečištěním životního prostředí, přechází se od identifikačních klíčů, které uváděly pouze pozitivní či negativní reakce, k tabulkám, v nichž je uvedeno procento kmenů daného druhu, u nichž je test pozitivní, eventuelně zda výsledek kolísá i u buněk určitého kmene. Hodnocení na destičce: • Odečítáme ENTEROtest pomocí průhledného víčka, kde je zkratkami zaznačeno pořadí reakcí • Identifikaci provedeme dle tabulky v návodu testu • Nebo pomocí programu TNW, který nám po vyplnění +/- k reakcím identifikuje náš kmen, ukáže v % identifikační skóre a T index. Pro typický kmen je T index roven 1. • Pro atypický kmen nám test doporučí případné další rozlišující testy či ukáže naše nestandardní výsledky Jako kontrola kvality použitých chemikálií a kontrola interpretace barevných reakcí se používají tzv.kontrolní kmeny bakterií, které dávají standardní výsledky. Tyto kontrolní kmeny dodává CCM v lyofilizovaném stavu nebo na želatinových discích. Shrnutí • Enterobakterie jsou gramnegativní tyčinky, 1-6 μm dlouhé a 0,3-1 μm široké, netvoří spory; pohyblivé druhy mají peritrichální bičíky (Proteus..) • Enterobakterie jsou nenáročné chemoautotrofní bakterie, mezofilní – rostou v rozmezí 18 - 40°C, optimum je 37°C • Po provedení oxidázového testu jsou enterobakterie oxidáza negativní (s.výjimkou rodu Plesiomonas, který k nim byl nedávno přiřazen), tvoří katalázu (kataláza pozitivní) a vždy štěpí glukózu (i tvorba plynu), dále redukují nitráty (při fakultativní anaerobióze jsou totiž nitráty akceptorem elektronů)