Změny aktivity transkripčního faktoru NF-kappaB ve vztahu k regulaci cytokinetiky Mgr. Jiřina Procházková, Ph.D. jipro@sci.muni.cz Osnova Struktura NF-kappaB Charakterizace členů rodiny NF-kappaB Klasická vs. alternativní dráha aktivace Transaktivace, ubiquitinace NF-kappaB a apoptóza NF-kappaB a imunitní systém NF-kappaB a proliferace NF-kappaB a stres NF-kappaB a karcinogeneze Metody detekce aktivního NF-kappaB NF-kappaB • Nuclear Factor - kappa B (NF-kB) - Jaderný faktor B lymfocytů, který se váže na enhancer pro gen kódující lehký k řetězec imunoglobulinů • Objeven v roce 1986 (Sen, Baltimore et al.) • PRO-SURVIVAL transkripční faktor • Aktivován min. 210 podněty a ovlivňuje transkripci min. 150 genů (Pahl 1999) • Úzká vazba na procesy proliferace, karcinogeneze, aktivace imunitního systému Struktura NF-kappaB dimerizace, jaderná lokalizace, vazba na DNA r ^ r maskují N LS, interakce protein-protein >v______ ~^ obsahuje rozpoznávací sekvenci pro kinázy ^ O O O O o* s * ř i NLS w og w « ni_v-» u- 4 ífl- 4Ü RHD GRR '—^^ ^ ^ DD PEST chrání protein před degradací v proteasomu, nutná pro správné štěpení proteinu CD T PI P) RHD Reí Homology Domain GRR Glycin-Rich Region S? | An k irrin repeats ■í ff- irt m I» 4 tv Processing-Inhibitory Domain f«, cd | DD I Dealn Domain NLS Nuclear Localization Signal I Cleavage sile aa 405 neubiquitinylovaná chrání před proteasom. degradací ^ NIK phosphorylation sile TD Transactivation Domain + IKKii phosphorylation site PEST rich in P, E, S, T aminoacids O Polyuíj iqu*Ünation sile Podle Dejardin (2006), Biochemical Pharmacology 72:1161-1179 Rodina NF-kappaB/lkappaB RHD ANK PEST H ' t "V NF-ťBl 1 g nnnononí ni™nw ■ i NF-KB2 G ()(>( )OOOOI P100/P52 p H RelA/p65 1 1 ^\ P N XTransaktivační Pel E? || 1 J " S .-„*-.. N o-Rtl 1 B kB« tťB(t kBe UBT (C terminus of NF-kBV pi 05) IrBA (C terminus of MF-kB2/ pi GO) Bel-3 S5 nnnnnowi r | ť km x x ynn Podle Caamano and Hunter (2002), Clinical Microbiology Reviews, 15 (3):414 Dimerizace členů rodiny NF-kappaB Table 1. NF-kB family proteins TADa domain Cytoplasmic form ^p65 (RelAT^) + Complex with IkB Classical NF-kB binding pairs by forming dimers with p&0 Regulated by the canonical NF-kB pathway RelB l Complex with pi00 Release of RelB-p52 dimers through activation of the non-canonical n pathway c-Rel l Complex with IkB The cellular homolog of the avian retroviral protein. v-Rel p50 Precursor protein Derived from processing of pi05 Homodimeric form has repressor function Transcriptionally active heterodimers with RelA or c-Rel p52 Precursor protein Derived from processing of pi00 Homodimeric form has repressor function Transcriptionally active heterodimers with RelA or c-Rel ^Abbreviations: c-Rel. cellular Rel: IkB. inh ibitor of k B: NF, nuclear factor; TAD, irans-activation domain: v-Rel. viral Rel. Yamamoto and Gaynor, (2004), TRENDS in Biochemical Sciences, 29 (2) NF-kappaB knock-outs i______ ^henotype Description NF-zíBr'" Defects in production of Ab and T-cell proliferative responses. Absence of marginal zone B cells. Defect in Th2 responses. Increased susceptibility to S. pneumoniae and L. monocytogenes. Normal response to E. coli infection and H. influenzae but enhanced resistance to EMCV. NF-kB?"'" Disorganized B- and T-cell areas in spleen and lymph nodes associated with absence of marginal zone macrophages and follicular DC. Reduced numbers of B cells and decreased production of antigen-specific Ab. Increased susceptibility to T. gondii, L. monocytogenes, and L. major but normal response to LCMV. NF-#eBi"'" NF Increased mortality after birth and developmental defects including osteopetrosis, thymic and lymph node atrophy, and disorganized splenic structure. RelA"'" Embryonic lethality at day 15 to 16 of gestation due to widespread apoptosis of liver parenchymal cells mediated by TNF. Required for formation of secondary lymphoid organs. Reiß-'- Development of lethal T-cell-mediated inflammatory disease. Impaired production of antigen-specific Ab associated with defects in germinal center formation. Lack of marginal zone B cells and thymic and CDStt" DC. Susceptible to L. monocytogenes, LCMV, and T. gondii. Reduced capacity to produce IFN-7 and impaired DTH responses. c-Rel"'" Impaired T- and B-cell proliferation and reduced Ab responses. Increased susceptibility to L. major and ľ. gondii. Memory response to influenza virus is impaired. Decreased production of IL-2, IL-3, IL-12, IFN-7, and GM-CSF. IieBft"'" Postnatal lethality 7 to 10 days after birth associated with widespread psoriasis-like dermatitis, increased granulopoiesis, and histological alterations in liver and spleen. Bcl-3~'~ Disorganized B- and T-cell areas in spleen. Impaired formation of germinal centers and production of antigen-specific Ab. Defective antigen-dependent priming of T cells. Increased susceptibility to L. monocytogenes, S. pneumoniae, and T. gondii but normal response to E. coli infection. IKK mutace Ectodermal dysplasia and immune deficiency (oportunní infekce) a Abbreviations: Ab, antibody CTL, cytotoxic T lymphocytes; DTH, delayed-type hypersensitivity; DC, dendritic cells, Thl, T helper cells type 1. Adapted from reference i with permission of the publisher. Caamano and Hunter (2002), Clinical Microbiology Reviews, 15 (3):414 Signálová dráha NF-kappaB TNF.X, IL-1, CM«., LPS, UV Hflhl kB 0*flr«lattftn Caamano and Hunter (2002), Clinical Microbiology Reviews, 15 (3):414 Transaktivace kB vazebné místo: ö'-GGGRNYYYCC-S' (R - purin, Y - pyrimidin, N jakákoli báze) JANSSEN-HEININGER et al. (2000), Free Radical Biology & Medicine,28(9):131713 Transkripční koaktivátory: P/CAF CBP/p300 HMG RNA pol 2 TFIIB TBP TAF Histon acetyl transferázová (HAT) aktivita cAMP response element (CREB) vázající protein, HAT aktivita High mobility group proteins - citlivost DNA k nukleázám RNA polymeráza 2 Nutný pro asociaci RNA pol. s iniciačním komplexem TATA-box vázající protein TBP asociovaný faktor UblquIHn-Profeosoflie ß©pani.de«t Proteolysis * ... ADP+PPi Í-U b Thioesler E2-S-C-Ub E2-Ub TNoester e* . ä O Protein Ubiquitin - 76 Akys E1- Ub. aktivující e. E2- Ub. přenášející e. E3- Ub. ligáza ß7 ß6 [35 [34 ! 263 20S IProteasome . NH C Ub Ib Isopepnde Pol yub iqu iti n ati on of Target Prút6in ©2005 ProteinLounge.com s a NF-KBCp50/p^lRA1TiHWAY ■oft > ľ TNFR ÍHÍÍ8 HP [íjjľí MyDaS. tE£C3 MyDae EHS LÖ233 ^^ffiM^ G55 V. C Kanonická dráha aktivace NF-kappaB Hlavní dimer p65/p50 S 0ĽĽ& . T /J. (T *6S * ©2003 ProtalnLounga.com Alternativní dráha aktivace NF-kappaB Aktivace - několik minut TNFR-related (LTbR, BAFF-R,CD40, Fn14, proteins RANK CD27, CD30, LMP1) Aktivace - několik hodin x^ p65 oř c-Rel Q*) Phosphorylation C---O-0 Polyuibiqultin linkage K48 Dejardin, biochemical pharmacology 72 (2006) 1161-1179 TNF SIGH MING PAIIMHrAV ÍSWit TNFa - prozánětlivý, proapoptotický cytokin Nejsilnější induktor NF-kappaB aktivace NIK-NF-kappaB indukující kináza IKK - IkappaB kináza MEKKs - MAPK/ERK kináza kinázy MAPK - Mitogenem aktivovaná protein kináza (JNK, p38, ERK) ERK - Extracelulárním signálem regulovaná kináza JNK-cJun N-terminální kináza p38 - stresem aktivovaná kináza ATOPICS» IHI0UGH DEATH RECEPTORS ©2003 ProteinLounge.eom •'■ft* ft* Cell Survival, Differentiation & Activation Cell Shrinkage & Membrane B leb bin g Pro-apoptotické cílové geny NF-kB: RIP, DR1-6, Fas, TNF-R Podpora přirozené imunity • Produkce pro-zánětlivých působků - Interleukiny, chemokiny, TNF; IFNß, RANTES - Imunoreceptory (TNF-R, MHCI, imunoglobuliny) - Buněčná adheze (ICAM1, ELAM1, VCAM1, selektiny, tenascin C) - Proteiny akutní fáze zánětu (faktory komplementu, CRP, LPS R, angiotensinogen) - Členové rodiny NF-kappaB • Anti-apoptotická role je spojena s podporou zánětlivého procesu - Apoptotická tělíska pohlcená makrofágy jsou neimunogenní • Role Bcl-3 v T lymfocytech - Vazba na homodimery p50 a p52 v jádře mění tyto represory na aktivátory transkripce • Podpora dozrávání B lymfocytů - IKKa podporuje aktivaci dimerů p52/RelB - produkce proteinů posilujících rezistenci B lymfocytů k apoptóze x PODPORA CHRONICKÉHO ZÁNĚTU!!! (revmatoidní artritída, kardiovaskulární nemoci, autoimunitní nemoci) Podpora proliferace Cytokiny a jejich receptory produkované působením NF-kappaB působí jako růstové faktory - Aktivuje geny pro G-, M-, GM-CSF, VEGF Aktivuje expresi cyklinu D1 nutného pro přechod G1/S Aktivuje expresi c-Myc - transaktivuje geny pro cykliny a potlačuje expresi p21 v G1,G2 fázi - hl. role Akt - fosforyluje IKK + Chk1 je inaktivní v S fázi je to naopak + role RelA a p100 Regulátor stresové odpovědi Stresory aktivující NF-kappaB: Infekce Ischemický/reperfúzní stres Hemorhagický šok Poškození jater Ozáření organismu (UV, y) • Oxidační (ROS (?) a NOS metabolizmus) Hyperglykemický stres Xenobiotický (cigaretový kouř, těžké kovy, PCB, cytostatika) NO metabolizmus Inflammatory Mediators a aktivace <= NO NO nitrosylace psabso; Cy&62 JANSSEN-HEININGER, et al.,Free Radical Biology & Medicine, 28, 9, 1317-1327, 2000 Vliv na karcinogenezi NF-kappaB Potlačuje rozvoj apoptózy + Indukuje proliferaci, angiogenezi + Zvyšuje metastatický potenciál + Podporuje zánětlivé procesy Podmínky vhodné pro karcinogenezi Karcinogenetický potenciál NF-kappaB janccr-asGrgcLvfrKJ indu-CniTi cit nhív.'ľinl NF-k (J 3^(1 vl|y in'ccfion Cunŕ^lh 11 ntťTčX rUH d pá if.K ■Hŕŕ k**-er; Onccgnrt activation I f*-. Bcr-AM| jltonttoo t ej iHiniKn TlITTMKJr proToter^ ROiiľducír;, NF.»B ■ iL-i IhF cnMw^ii AngkjporiMis ^VfOŕ.THlf. ILL í.* Survival IKAU-I. iKiM-i, (fca-.L HAŕ TumöUf pf Ufnoíioi i . ■. '.» MUP4 uP> ProfriujilTOfi (CříilriDi. cVyn\ Tumour prům&tJrifl luňtliůhft ůl otrtrfflnl NF-ľB «UUty http://www.dundee.ac.uk/biocentre/SLSBDIV3ndp.htm Modulace aktivity NF-kappaB Tumor promoter NF-k-B Tumor suppressor N F-kB TRENDS in Cell Biology Tumor supresorové proteiny p53 a ARF indukují asociaci aktivního NF-kappaB s HDAC1 => Represe NF-kappaB aktivity Loss of tumor suppressor genes Norma ^>rľ>rľ>i ď~^> Malignant cancer cells c Activation of tu mor Activating stimulus Tumor suppressors (p53. ARF) (IKK activity, tumor promoter /V^^NX microenvironment. NF-k-B LA \> accumulation of Tuinor Tumor genetic alteration) promoter suppressor NF-k-B NF-k-B TRENDS in Cell Biology Perkins (2004), Trends in Cell Biology, 14(2) t Detekce aktivního NF-kappaB WB - Degradace IkappaB - Nárůst p50 a p65 v nukleárním extraktu a úbytek v cytoplazmatickém extraktu EMSA - Electrophoretic Mobility Shift Assay » NF-kappaB v nukleárním extraktu se váže na značené oligonukleotidy obsahující kB vazné místo » Detekce komplexu nativní PAGE Reportérovy plazmid - Transfekce buněk plazmidem nesoucím kB vazná místa v promotoru genu pro luciferázu/B-gal/CAT Shrnutí Rodina transkripčních faktorů NF-kappaB Klasická vs. alternativní dráha aktivace Nejsilnější aktivátor NF-kappaB je TNF-a Pro-zánětlivé a přežití podporující účinky Aktivován stresem Podílí se na rozvoji chronického zánětu a nemocí s ním spojených Podporuje rozvoj nádorových onemocnění