Biologie vitaminu A a jeho úloha veBiologie vitaminu A a jeho úloha ve
fyziologii živočichůfyziologii živočichů
E-mail: jipa@sci.muni.cz
Tel: 532 146 223 / 116
KAROTENOIDY
von Linting, 2006
RETINOIDY
- Vitamin A jsou obecně lipofilní látky podobné struktury a aktivity (retinol,
RETINOIDY
- Vitamin A jsou obecně lipofilní látky podobné struktury a aktivity (retinol,
retinal, kyselina retinová)
- Prekurzory retinoidů jsou karotenoidy, zejména -karoten (~ 50 z >400 je
využitelných)využitelných)
- Nejdůležitejším derivátem je kyselina retinová (RA), odvozená od retinalu
retinyl estery <-> retinol <-> retinal <-> kyselina retinová
(vit. A) (RA ­ retinoic acid)
- Tělo je přijímá v potravě, karotenoidy v rostlinné, vitamin A a jeho deriváty v
živočišné
Retinol equivalent (RE) = retinol v potravě ( g) + -karoten ( g) + ostatní karotenoidy ( g)
6 12

6 12
RE u žen ~ 800 g na den
RE u mužů ~ 1000 g na den
STRUKTURY NEJBĚŽNĚJŠÍCH PŘIROZENÝCH RETINOIDŮSTRUKTURY NEJBĚŽNĚJŠÍCH PŘIROZENÝCH RETINOIDŮ
Ross, 2000
Distribuce retinoidů v organismu
Retinoidy jsou resorbovány v tenkém střevě, v enterocytech se karotenoidy mění naRetinoidy jsou resorbovány v tenkém střevě, v enterocytech se karotenoidy mění na
aktivní retinoidy (retinyl estery), s lipidy a dalšími lipofilními látkami tvořícími
chylomikrony jsou uvoněny do lymfatického systému odkud se postupně uvolňují do
celkového tělního oběhu. Zásoba je vytvářena v játrech (50-85% celkového) v
lipidových kapénkách ve hvězdicovitých buňkách jater.
karoteny & retinoidy
(potrava) retinyl esteryretinyl estery
Distribuce retinoidů v organismu
- 90% retinoidů je v těle v podobě retinyl esterů v lipidové složce chylomikronů,
část jich může být i přímo v buněčných membránách.
- beta-karoteny mohou být navíc uloženy v tukové tkáni
- v případě potřeby (mobilizace zásob) je retinol uvolňován z jater do krve,
vázaný s v hepatocytech syntetizovaným proteinem RBP (retinol vázajícívázaný s v hepatocytech syntetizovaným proteinem RBP (retinol vázající
(binding) protein). Tento komplex (holo-RBP) se váže s transthyretinem (TTR,
prealbumin), čímž je zabráněno vylučování retinolu v ledvinách. Takto v
plasmě cirkulující retinol je připraven ke zpracování v cílových buňkách.plasmě cirkulující retinol je připraven ke zpracování v cílových buňkách.
- K přeměně na koněčné funkční retinoidy dochází až v místě spotřeby.- K přeměně na koněčné funkční retinoidy dochází až v místě spotřeby.
! Retinoidy tedy působí zejména autokrinně a parakrinně !
Výběr nejvýznamějších oblastí vyžadujících metabolizmus retinolu/vit.A
A) fotorecepce B) růst a vývoj organismu
Ross, 2000
ÚLOHA RETINOIDŮ VE FOTORECEPCI
retinyl estery <-> retinol <-> retinal <-> kyselina retinováretinyl estery <-> retinol <-> retinal <-> kyselina retinová
(vit. A) (RA ­ retinoic acid)
MECHANISMUS REGULACE RŮSTU A VÝVOJE ORGANISMU RETINOIDY
V regulaci ontogeneze je klíčovým
retinoidem kyselina retinová ­ RA,retinoidem kyselina retinová ­ RA,
a to její izoformy all-trans a 9-cis.
Ross, 2000Ross, 2000
McCaffery, 2000
Kyselina retinová (RA)
MORFOGEN & TERATOGEN
PLEIOTROPNÍ VLASTNOSTI
V průběhu embryonálního vývoje je metabolismus RA nezbytný zejména pro formování tělní osyV průběhu embryonálního vývoje je metabolismus RA nezbytný zejména pro formování tělní osy
a segmentaci (Hox geny), vývoj CNS, očí, srdce, ledvin, pohlavních orgánů, a epitelů obecně.
U dospělců se pak podílí zejména na udržování homeostáze imunitního systému, epitelů a zrání
pohlavních buněk (spermatogenezi).
Proteiny regulující účinky RA v buňce
pohlavních buněk (spermatogenezi).
Proteiny regulující účinky RA v buňce
a) Enzymy
Metabolismus retinoidů, zejména oxidace.
a) Retinoidy vázající proteinya) Retinoidy vázající proteiny
Zásoba v buňce, regulace jejich intracelulární koncentrace, transport.
a) Jaderné receptory RA (transkripční faktory)a) Jaderné receptory RA (transkripční faktory)
Realizace transkripce na RA závislých i nezávislých genů.
ENZYMY metabolismu RA
ENZYMY - IENZYMY - I
Retinol dehydrogenázy : oxidace RETINOLU -> RETINALALDEHYDRetinol dehydrogenázy : oxidace RETINOLU -> RETINALALDEHYD
Dvě skupiny alkoholdehydrogenáz, třída I a IV. Přitom třída I se zdá málo významnáDvě skupiny alkoholdehydrogenáz, třída I a IV. Přitom třída I se zdá málo významná
pro metabolismus retinoidů, oproti třídě IV, kterou lze detekovat v oblastech intenzivního
metabolismu retinoidů od 10 dpc (myš). Pravděpodobně se ale uplatňují i membránověmetabolismu retinoidů od 10 dpc (myš). Pravděpodobně se ale uplatňují i membránově
vázané alkohol dehydrogenázy (známe 2 co oxidují retinol), upřednostňují však pouze
9-cis isomery.9-cis isomery.
ENZYMY - II
2) Retinaldehyd dehydrogenázy : oxidace RETINALDEHYDŮ -> KYSELINU RETINOVOU
Tato reakce může být katalyzována i aldehyd nebo xanthin oxidázami, ale převážně je řízenaTato reakce může být katalyzována i aldehyd nebo xanthin oxidázami, ale převážně je řízena
retinaldehyd dehydrogenázami. Byly identifikovány 3 typy, RALDH, které s liší specifitou
k retinaldehydům a distribucí v organismu.
RALDH1 (=AHD2, ALDH1) ačkoliv je relativně málo aktivní, je silně exprimován v retině, a tak
prakticky všechna RA v retině je produktem tohoto enzymu. Dále je během embryogeneze
exprimován ve středním mozku (mesencefalon) a v corpus striatum. Váže také androgenyexprimován ve středním mozku (mesencefalon) a v corpus striatum. Váže také androgeny
a je možné, že tak zprostředkovává interakci mezi RA a androgenními jadernými receptory.
RALDH2 je vysoce selektivní k retinaldehydům. Začíná se exprimovat již v průběhu gastrulace
A odpovídá za produkci RA ve všech tkáních závislých na RA (mozek - zejména motoneurony,
mícha, srdce, ledviny, pohlavní orgány,...). RALDH2 -/- embrya hynou v důsledku neuzavřenímícha, srdce, ledviny, pohlavní orgány,...). RALDH2 -/- embrya hynou v důsledku neuzavření
nervové trubice a poruch ve vývoji srdce, přídavkem RA, lze tyto efekty potlačit.
RALDH3 (=V1) je sice vysoce aktivní enzym, ale málo specifický k oxidaci rentinaldehydům.RALDH3 (=V1) je sice vysoce aktivní enzym, ale málo specifický k oxidaci rentinaldehydům.
U časných embryí je exprimován ve ventrální části retiny a v gangliích koncového mozku
(telencephalon). Později je přítomen zejména v játrech a kůži. Společně s RALDH1 u embryí
katalyzuje přeměnu gamma-aminobutyraldehydu na GABA.
ENZYMY - III
CYP26 (=P450RAI) : oxidace KYSELINY RETINOVÉ -> KYSELINU 4-OXORETINOVOU
(Hydroxyláza kyseliny retinové, dvě formy CYP26A1 a CYP26B1)
CYP26 je členem velké rodiny cytochromů P450. V současné době je jediným známým enzymem
katabolizujícím RA. Exprese CYP26 je indukována RA, a je přítomen minimálně ve všechkatabolizujícím RA. Exprese CYP26 je indukována RA, a je přítomen minimálně ve všech
buňkách s metabolismem RA a v buňkách citlivých k působení RA. Jeho podíl na deaktivaci RA
není však plně objasněn. Např. u žab, 4-oxoRA je silným aktivátorem receptorů RA a tak
i buněčných regulací citlivých k RA.i buněčných regulací citlivých k RA.
Je pravděpodobné, že enzymů metabolizujících retinoidy je více, avšak s menším významemJe pravděpodobné, že enzymů metabolizujících retinoidy je více, avšak s menším významem
než výše jmenovaní. Jejich exprese, podobně jako syntéza RA je v průběhu embryonálního
vývoje velice dynamická v závislosti na typu tkáně a vývojovém období. Obecně je souhra v jejich
expresi a aktivitě nezbytná pro segmentaci (zejména regulace Hox genů) vyvíjejícího se embrya.
Retinoidy vázající proteiny
1) Intracelulární1) Intracelulární
a) Buněčný retinol vázající protein (CRBP ­ cellular retinol binding protein)a) Buněčný retinol vázající protein (CRBP ­ cellular retinol binding protein)
Váže retinol i retinaldehyd a chrání je před oxidacemi a světlem. Retinol vázaný
na CRBP-1 však může být oxidován na retinaldehyd retinol dehydrogenázou.na CRBP-1 však může být oxidován na retinaldehyd retinol dehydrogenázou.
Uvolněný retinaldehyd je pak přístupný pro oxidaci RALDH na RA.
b) Buněčný RA vázající protein (CRABP ­ cellular RA binding protein)
CRABP-I chrání RA před další metabolizací podobně jako CRABP-II, kterýCRABP-I chrání RA před další metabolizací podobně jako CRABP-II, který
je však přítomen nejen v cytoplasmě, ale i v jádře, asociuje s receptory pro RA
a slouží tak i jako transkripční regulátor / kofaktor.
Je zajímavé, že absence CRBP a CRABP (knock-out myši) má minimální účinek
na fenotyp organismu, na rozdíl od vypnutí některého z enzymů (viz. výše) nebo
receptorů (viz. níže).
Retinoidy vázající proteiny
2) Vázané na membránu
Megalin (gp330 / LRP-2) - patrří do rodiny LDL (low-density lipoprotein)
receptorů. Je exprimován v membránách zejména epiteliálních buněk a sloužíreceptorů. Je exprimován v membránách zejména epiteliálních buněk a slouží
jako receptor pro RBP a retinol (a také sonic hedgehog (Shh)). Megalin
zprostředkovává transport retinolu (vázaného jak na RBP tak LDL) skrze vrstvyzprostředkovává transport retinolu (vázaného jak na RBP tak LDL) skrze vrstvy
epiteliálních buněk, ale i do jejich intracelulárního prostoru. V ledvinách se podílí
i na transportu dalších lipofilních vitaminů (např vit. D + vit. D vázající protein, vit.
B12 + transcomalamin). Komplex ligand ­ megalin je pohlcen procesem
endocytózy a vzniklý endosom cestuje buňkou na místo určení.
Receptory RA
Receptor RA = RAR = retinoic acid receptor (RAR, RAR, RAR + isoformy)
RAR je aktivovaný jak all-trans RA, tak 9-cis RARAR je aktivovaný jak all-trans RA, tak 9-cis RA
Receptor retinoidu X = RXR = retinoid X receptor (RXR, RXR, RXR + isoformy)
RXR je aktivovaný pouze 9-cis RARXR je aktivovaný pouze 9-cis RA
RA receptory patří do rodiny jaderných receptorů společně s receptory
thyroidních hormonů, receptorem vit. D, receptory aktivujícími
peroxisomové proliferátory (PPARs), jaterním X Receptorem (LXR),
farsenoidovým receptorem (FXR) a se sirotčími (orphan) receptory. S
těmi zde jmenovanými RXR tvoří také heterodimery regulující transkripci
mnoha ontogeneticky významných genů.
Regulace genů řízených RA je zprostředkována jejími receptory, které
zároveň slouží i jako transkripční faktory. Vytvářejí funkční homozároveň slouží i jako transkripční faktory. Vytvářejí funkční homo
(RAR/RAR, RXR/RXR) i heterodimery (RAR/RXR), přičemž heterodimery
jsou výrazně transkripčně silnější/aktivnější. Jejich kombinace (48) jsoujsou výrazně transkripčně silnější/aktivnější. Jejich kombinace (48) jsou
specifické pro konkrétní promotorové sekvence (response elements) v
promotorech RA indukovaných genů.promotorech RA indukovaných genů.
Signální dráha jaderných receptorůSignální dráha jaderných receptorů
ligandy
NR jaderné (nuclear)
receptory
NR
receptory
transkripce on / off ?
TF
NR NR
transkripční
faktory
DNA
TF
TF
NR transkripce on / off ?
DNA
Příklady promotorových sekvencí s RAR/RXR vazebnými místyPříklady promotorových sekvencí s RAR/RXR vazebnými místy
Ross, 2000
Srovnání některých defektů vyvolaných nedostatkem RA (RAD),Srovnání některých defektů vyvolaných nedostatkem RA (RAD),
oproti vyřazení jednotlivých receprotů RAR nebo RXR
Ross, 2000
Obecně vyřazení jednotlivých isoforem receptorů (homozygoti -/- RAR1,
RA2 nebo RAR2) nemá žádný zásadní účinek na fenotyp takových zvířat.RA2 nebo RAR2) nemá žádný zásadní účinek na fenotyp takových zvířat.
Po vyřazením jednotlivých subtypů, však již můžeme pozorovat různé
malformace a nedostatečnosti. Z RAR se jeví nejvýznamnější RAR.
Větší účinek má vyřazení RXR, které je způsobeno pravděpodobně jejich
úlohou při vytváření heterodimerů s ostatním jadernými receptory. RXR -/-,
hyne 13.5-16.5 dpc, z důvodu nedostatečně vyvinutého srdce, má také
nedostatečně vyvinuté oči. RXR -/- je viabilní ale samci jsou sterilní.
Interakce transkripční aktivity RA a některých drah transdukce signálu
Aktivní komplex RAR/RXR v mnoha případech působí jako represor v promotorech
rozpoznávaných také AP-1 (Jun/Fos komplexy) a Smad proteiny (TGF rodina).
Na druhou stranu, aktivita RA receptorů může být modifikována jejich fosforylacíNa druhou stranu, aktivita RA receptorů může být modifikována jejich fosforylací
na serinových a threoninových zbytcích serin/threonin kinázami. A to zejména MAPK
kinázami (Erk; JNK1,2,; p38), protein kinázou A (PKA) a na cyklinu H závislou cdk7.
Tyto postranslační modifikace RA receptorů vedou k další variabilitě v možnostechTyto postranslační modifikace RA receptorů vedou k další variabilitě v možnostech
regulovat RAR/RXR řízenou transkripci jak pozitivně, tak negativně a to i za nepřítomnosti
ligandu (RA). Modifikují, zejména interakce s dalšími proteiny transkripčního komplexu.
Některé fosforylace (např. p38 -> RAR) indukují degradaci daných receptorů)Některé fosforylace (např. p38 -> RAR) indukují degradaci daných receptorů)
Inhibice AP-1 zprostředkované
transkripce kyselinou retinovou
RXR / RXR
Serinové a threoninové zbytky fosforylované () u RAR/RXR receptorů,
ukázány jsou i potencionálně fosforylovatelné(čísla)ukázány jsou i potencionálně fosforylovatelné(čísla)
A/B DC FE
LBD/AF-2DBDAF-1
N- -CA/B DC FE
EEIVPS74PPS77PPPLPRRAR1 RKRRPS369RP
EELVPS67PPS70PLPPPR
EEMVPSS66PS68PPPPPR
RAR2
RAR2
RKRRPS362KP
RRRRPS360QP
PKAMAPKs + cdk7
LBD/AF-2DBDAF-1
EEMVPSS77PS79PPPPPR RRRRPS371QPRAR1
A/B DC ERXR N- -C
SSSLNS22PTGR....S44P.. S48P.. S54P... SS61P.. SS75P..PTT87P S96P..S101P LNPSS265PNDP
AF-1 (A/B doména) ­ oblast regulující aktivaci transcripce, nezávisle na ligandu
DBD (C doména) ­ DNA vázající doména (DNA-binding domain)
LBD/AF-2 (D/E doména) ­ oblast regulující aktivaci transkripce, závislé na ligandu
JNK1 + JNK2
Systém pro detekci RA v buňkách/tkáních
(RARE-LacZ reportér)
X-Gal X-Gal
X-Gal
RA -galaktozidáza
X-Gal
X-Gal
X-Gal
X-Gal
RA
RA
RA
RARE * LacZ
RAR RXR
Xn*
RARE * LacZ
*další faktory/sekvence nezbytné pro funkci promotoru
Exprese a aktivita RALDH-2 v mozku myšího embrya (16 dpc)
A) In situ hybridizace mRNA RALDH-2
B + C) RARE aktivita (RARE-LacZ reporter)
2 ds postnatal
13 dpc
2 ds postnatal
13.5 dpc 16 dpc
Detekce epxrese CYP26 (in situ mRNA hybridizace)
v retině (A) a RARE aktivita (RARE-LacZ reporter)
v embryonální retině (čelní a zadní pohled)(B)
McCaffery, 2000
Literatura ke studiuLiteratura ke studiu
1. Clagett-Dame, M., and L. A. Plum. 1997. Retinoid-Regulated Gene Expression in Neural
Development. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression 7:299-342.
2. Clagett-Dame, M., and H. F. DeLuca. 2002. The Role of Vitamin A in Mammalian Reproduction and2. Clagett-Dame, M., and H. F. DeLuca. 2002. The Role of Vitamin A in Mammalian Reproduction and
Embryonic Development. Annu. Rev. Nutr. 22:347-381.
3. Maden, M., and M. Hind. 2003. Retinoic Acid, A Regeneration-Inducing Molecule. Developmental
Dynamics 226:237-244.Dynamics 226:237-244.
4. McCaffery, P., and U. C. Drager. 2000. Regulation of retinoic acid signaling in the embryonic nervous
system: a master differentiation factor. Cytokine & Growth Factor Reviews 11:233-249.
5. McCarthy, R. A., and W. S. Argraves. 2003. Megalin and the neurodevelopmental biology of sonic
hedgehog and retinol. J. Cell Science 116:955-960.hedgehog and retinol. J. Cell Science 116:955-960.
6. Napoli, J. L. 1999. Interactions of retinoid binding proteins and enzymes in retinoid metabolism.
Biochimica et Biophysica Acta 1440:139-162.
7. Rochette-Egly, C., and P. Chambon. 2001. F9 embryocarcinoma cells: a cell autonomous model to7. Rochette-Egly, C., and P. Chambon. 2001. F9 embryocarcinoma cells: a cell autonomous model to
study the functional selectivity of RARs and RXRs in retinoid signaling. Histol Histopathol 16:909-922.
8. Ross, S. A., P. J. McCarffery, U. C. Drager, and L. M. De Luca. 2000. Retinoids in Embryonal
Development. Physiological Reviews 80:1021-1054.