Biologie cytokinůBiologie cytokinů rodiny gp130/IL-6rodiny gp130/IL-6 e-mail: jipa@sci.muni.cze-mail: jipa@sci.muni.cz Tel: 532 146 223 / 116 Gp130/IL-6 rodinaGp130/IL-6 rodina - Rodina cytokinů sdílejících transmembránový receptor, glykoprotein - gp130.glykoprotein - gp130. - gp130/IL-6 cytokiny nálěží do cytokinové třídy I, do skupiny- gp130/IL-6 cytokiny nálěží do cytokinové třídy I, do skupiny s dlouhými řetězci tvořené 4 těsně semknutými -helixy (A). - Na rozdíl od ostatních cytokinů třídy 1, jejichž hlavní funkce je regulace hematopoetického a lymfatického systému, gp130 cytokiny majíhematopoetického a lymfatického systému, gp130 cytokiny mají významné uplatnění i v ostatních buněčných systémech v rámci regulace ontogeneze a homeostáze. - Obecně regulují proliferaci, diferenciaci a apoptósu u imunitního, hematopoetického, nervového, kardiovaskulárního a endokrinníhohematopoetického, nervového, kardiovaskulárního a endokrinního systému. Dále se uplatňují v metabolismu kostní a tukové tkáně, v zánětu a v indukci akutní odpovědi na zánět.zánětu a v indukci akutní odpovědi na zánět. - V současné době je nejlépe zmapován jejich význam v hematopoéze,- V současné době je nejlépe zmapován jejich význam v hematopoéze, imunitní odpovědi, neurogenezi, adipogenezi a reprodukci. - Předpokládá se, že gp130 indukovaná kaskáda transdukce signálu hraje jednu z klíčových rolí v regulaci kmenových buněk obecně.hraje jednu z klíčových rolí v regulaci kmenových buněk obecně. IL-6 ­ interleukin-6 Specifické receptory k jednotlivým ligandům Gp130 / IL-6 cytokiny (ligandy) IL-6 ­ interleukin-6 IL-11 ­ interleukin-11 LIF ­ leukemia inhibitory factor CT-1 ­ cardiotrophin-1 IL-6-R IL-11-R CNTF-R Nesignalizující receptory - CT-1 ­ cardiotrophin-1 CNTF ­ ciliary neurotrophic factor OSM ­ oncostatin M CNTF-R CLF OSM-R LIF-R receptory - SignalizujícíOSM ­ oncostatin M CLC ­ cardiotrophin-like cytokine Po navázání ligandu na specifický receptor se tento komplex váže s na LIF-R Signalizující receptory - Po navázání ligandu na specifický receptor se tento komplex váže s na receptor gp130 za vzniku stabilního komplexu a spouští se transdukce signálu IL-6 IL-11 LIFIL-6 IL-11 LIF CT-1CT-1 IL-6-R IL-11-R CNTF-RLIF-R CNTF ! OSMOSM-R CLF CLC Gp130* ! OSMOSM-R Gp130* *gp130 samotný má k ligandům velice nízkou afinitu, tím je zabráněno aktivaci gp130 samotným ligandem! Komplexy tvořené cytokiny IL-6 rodiny s jejich receptory Nesignalizující receptory váží dva signalizující receptory, gp130 případně LIFR Heinrich 2003 Nesignalizující receptory váží dva signalizující receptory, gp130 případně LIFR * IL-6 a IL-11 ­> jejich receptor váže dvě molekuly gp130 * LIF, CT-1, CNTF, CLC ­> sdílejí receptor LIF-R, který se po navázání ligandu váže k jedné molekule gp130. CNTF a CLC sdílejí dále CNTF-R tvořící tak receptorovýjedné molekule gp130. CNTF a CLC sdílejí dále CNTF-R tvořící tak receptorový hetero-trimer. * OSM ­> se kromě LIF-R váže i na OSM-R Příklady struktury receptorů gp130 cytokinů gp130-R extracellular G-CSFRgp130 LIFR IL-12R IL-6R CNTFR IL-11R intracellular Receptory cytokinů třídy 1Receptory cytokinů třídy 1 IL-6 cytokiny ­ regulace a funkce - Jednotlivé IL-6 cytokiny jsou ve svých účincích z velké části vzájemně zastupitelní - Specifičnost účinků je dána přítomností specifického receptoru na povrchu nebo v okolí buněk, ale také koncentrací jednotlivých cytokinů - gp130 je přítomen prakticky na všech buňkách - Membránově vázaný, receptor může být nahrazen- Membránově vázaný, receptor může být nahrazen solubilním (IL-6-R, IL-11-R, LIF-R, CNTF-R, gp130 ­ patrně působí jako competitor k membránově vázaným variantám, nebo jako -receptor. In vivo byl v plasmě prokázán IL-6-R Pro experimentální účely byl připraven komplex IL-6 / IL-6-R = tzv. hyper-IL-6,komplex IL-6 / IL-6-R = tzv. hyper-IL-6, který aktivuje gp130 vždy. Rose-John2002 IL-6 IL11 LIF OSM CNTF CT-1IL-6 IL11 LIF OSM CNTF CT-1 Udržení pluripotentních buněk (ES) -/+ - + + + + buněk (ES) Diferenciace do makrofágů (M1) + - + + -/+ +makrofágů (M1) Růst myelomových buněk + + + + + nd PodporaPodpora trombopoesy + + + + nd nd Indukce proteinů + + + + + +akutní fáze + + + + + + Indukce ACTH -/+ + + + nd nd Neurální diferenciace + + + + + + Indukce osteoklasrů + + + + nd nd Srdeční hypertrofie -/+ + + + -/+ +Srdeční hypertrofie -/+ + + + -/+ + IL-6 a IL-11 (hematopoetické a imunitní buňky, fibroblasty) se uplatňují zejména v regulaci hematopoésy a imunitní odpovědi.se uplatňují zejména v regulaci hematopoésy a imunitní odpovědi. Obecně podporují proliferaci a diferenciaci hematopoetických progenitorů. IL-6 indukuje produkci protilátek B-lymfocyty. IL-11 podporuje vznik NKIL-6 indukuje produkci protilátek B-lymfocyty. IL-11 podporuje vznik NK buněk, a podílí se na zdravém vývoji placenty. IL-6 patří také mezi myokiny. LIF (široké spektrum buněk, zejména mezenchymálního původu) má zásadní význam v reproducki, je nezbytný pro usazení blastocysty vmá zásadní význam v reproducki, je nezbytný pro usazení blastocysty v děložní sliznici a pro přežívání a růst spermatocytů. V průběhu neurogeneze indukuje vznik astrocytů z neurálních progenitorů, indukujeneurogeneze indukuje vznik astrocytů z neurálních progenitorů, indukuje diverzifikaci některých typů neuronů (např adrenergní na cholinergní). Celkově s podílí na regulaci diferenciace motoneuronů. V hematopoéseCelkově s podílí na regulaci diferenciace motoneuronů. V hematopoése indukuje zejména diferenciaci buněk myeloidní řady. Blokuje transport lipidů do adipocytů. V játrech indukuje produkci proteinů akutní fáze zánětu.do adipocytů. V játrech indukuje produkci proteinů akutní fáze zánětu. Podílí se na růstu kostí, zvyšuje resorpci vápníku i počet osteoklastů, zároveň zvyšuje i počet osteoblastů. Působí hypertrofně na svalové buňky (i srdeční). Je hlavní regulátor produkce ACTH. CNTF, CLC a CT-1 (hlavně neurální buňky ­ glie, astrocyty) působí zejména v průběhu neurogeneze, podobně jako LIF. Svalypůsobí zejména v průběhu neurogeneze, podobně jako LIF. Svaly produkovaný CT-1 reguluje jejich spojení s motoneurony, podporuje přežívání a růst kardiomyocytů. CNTF brání demyelinizaci neuronu.přežívání a růst kardiomyocytů. CNTF brání demyelinizaci neuronu. Uplatňují se ovšem i v hematopoése. (2.3 % japonců jsou CLC -/-, myši mají podobný fenotyp jako CNTF -/-)mají podobný fenotyp jako CNTF -/-) OSM (monocyty, lymfocyty) v hematopoése regulace trombopoésy a erytropoésy, v neurogenezi podpora motoneuronů. LIF a IL-11 a zahnízdění (implantaci / nidaci) blastocysty ve sliznici dělohy (endometriu) a) estrogen a progesteron, zvyšují proliferaci a diferenciaci buněk sliznice b) Estrogen indukuje produkci LIF žlázkami endometria. LIF je produkován do lumen dělohy kde aktivuje buňky luminálního epitelu k produkci mnoha genů zahrnujících i faktory buněčnémnoha genů zahrnujících i faktory buněčné adheze jako jsou Coch a CD9. c) Invaginující blastocysta spouští procesyc) Invaginující blastocysta spouští procesy decidualizace řízené prostaglandiny (produkovanými Cox-2) a IL-11 Hondo, 2004 Požkození způsobené nadbytkem LIFPožkození způsobené nadbytkem LIF Myším byly transplantovány buňky produkující zvýšené množství LIF. Tyto buňky se přednostnězvýšené množství LIF. Tyto buňky se přednostně usazují v kostní dřeni a ve slezině. Po 2-3 měsících dochází ke ztrátě hmotnosti, kachexii, nervozitě a hypermobilitě myší (A).kachexii, nervozitě a hypermobilitě myší (A). Detekujeme také zvýšenou proliferaci v dřeni dlouhých kostí (B), kalcifikaci v játrech, srdci a svalech. Dále pozorujeme ztrátu tukové tkáně, atrofii thymu, absenci žlutého tělíska v ováriu, absenci spermatogonií v semenotvornýchabsenci spermatogonií v semenotvorných kanálcích (C). Nadbytek hyper-IL6 zesílení tlouštky stěn srdečních komor, hematopoéza mimo kostní dřeň, thrombocytózy, plasmacytomy, hyperplasie hepatocytů Metcalf, 2003 plasmacytomy, hyperplasie hepatocytů Myši deficientní k některému z IL-6 cytokinům jsou životaschopné a sMyši deficientní k některému z IL-6 cytokinům jsou životaschopné a s výjimkou LIF -/- i plodné. Jsou však menší, s poruchami hematopoésy, adipopoésy, a s nedostatečnou imunitní odpovědí. LIF, CNTF, CT-1, CLC -/- mají také nedostatečně vyvinuté motoneurony a jejich propojení se-/- mají také nedostatečně vyvinuté motoneurony a jejich propojení se svaly, jsou hypermotorické, ale na pokraji smrti. Mnohem zásadnější význam má absence / nefunkční mutace jejich receptorů. Gp130 - / -Gp130 - / Myši hynou během embryonálního vývoje v (8-12 den ~ organogeneze, 20-22 ds celkový), v důsledku poruch v hematopoéze, neurogenezi, kardiogeneze, hepatogenezi,... IL-6R -/- ??? LIF-R - / IL-6R -/- ??? LIF-R - / Myši hynou před a těsně po narození, zejména v důsledku chyb v neurogenezi, hematopoéze, celkovém metabolismu (hypoxie v důsledku špatně vyvinuté placenty) a nedostatečně vyvinuté kostry. IL-11Ra -/-IL-11Ra -/Normální hematopoéza, ale změny v tvorbě kostní tkáně, neplodné samice v důsledku chyb ve vývoji placenty. Některé imbrední kmeny myší mají navíc IL-11-Ra2 OSM-R - / Výrazné snížení krvetvorby, jak na úrovni progenitorů, tak v počtu periferních elementůelementů CNTF-R - / Poškozené motoneurony => myši hynou hlady pro neschopnost sát CLF -/Poškozené motoneurony => myši hynou hlady pro neschopnost sátPoškozené motoneurony => myši hynou hlady pro neschopnost sát Význam transdukce signálu gp130 ve vývoji kostíVýznam transdukce signálu gp130 ve vývoji kostí (Sims 2008) Transdukce signálu gp130 cytokinů Ernst 2004 Komplex ligand / vysoce afinitní receptor / gp130 spouští několik paralelních drah transdukce signálu, hlavní / fyziologicky nejvýznamnější se zdá dráha JAK ->drah transdukce signálu, hlavní / fyziologicky nejvýznamnější se zdá dráha JAK -> STAT. Heinrich 2003 JAK ­ Janusova kináza (tyrosin kináza)JAK ­ Janusova kináza (tyrosin kináza) STAT ­ transduktor signálu a aktivátor transkripce (signal transducer and activator of transcription) Rovnováha mezi JAK/STAT a Ras/Erk signalizací při aktivaci gp130 receptoru Ernst 2004 Biologická odpověd pro různě aktivní gp130 receptor Ernst 2004 Heinrich 2003Regulace signální kaskády gp130 cytokinů je také regulovány specifickými protein tyrosinspecifickými protein tyrosin fosfatázami. V signalizaci gp130 cytokinů hraje klíčovou roli tyrosincytokinů hraje klíčovou roli tyrosin fosfatáza SHP2. Zde (gp130 a LIFR) spouští signalizaci kaskádouspouští signalizaci kaskádou Ras/Erk (MAPK). V případě zapojení OSMR, je nahrazenazapojení OSMR, je nahrazena adaptérovým proteinem Shc. Komplex OSM / OSMR / gp130 aktivuje Erk (MAPK) dráhu přes Shc a ne přes SHP2 jako LIF-R a gp130. V některých případech je preferenčně je aktivovánaSHP2 jako LIF-R a gp130. V některých případech je preferenčně je aktivována dráha Erk a STAT5. Heinrich 2003 Liu, 1998 Boiani & Scholer 2005 aktivace regulaceaktivace (JAKs) regulace STAT1 Tyr701 Ser727STAT1 Tyr701 Ser727 STAT2 Tyr690 STAT3 Tyr705 Ser727 STAT4 Ser721 STAT5a/b Tyr694 Ser725/S730STAT5a/b Tyr694 Ser725/S730 STAT6 Tyr641 STATs jsou fosforylovány na serinech kinázami PKCd, Erk, JNK, p38.STATs jsou fosforylovány na serinech kinázami PKCd, Erk, JNK, p38. Význam této fosforylace a ani její přesný mechanismus není objasněn. Zdá se, že tato fofsforylace může zvyšovat transkripční aktivitu proteinů STAT. Další významné signální dráhy aktivované gp130 cytokiny aktivací JAK jsou: a) Tyrosin-kinázy Src rodiny: Hck (IL-6, LIF), cYes (LIF)a) Tyrosin-kinázy Src rodiny: Hck (IL-6, LIF), cYes (LIF) b) PI3K (fosfoinositol-3 kináza, PI3K -> Akt (PKB)) Obě tyto dráhy jsou zodpovědné zejména za pro-proliferační a anti-apoptickéObě tyto dráhy jsou zodpovědné zejména za pro-proliferační a anti-apoptické účinky gp130 aktivace. Aktivovaný receptor gp130 také asociuje s PKC, jež fosforyluje jeho Thr890Aktivovaný receptor gp130 také asociuje s PKC, jež fosforyluje jeho Thr890 a zvyšuje tak afinitu tohoto receptoru k STAT3. Regulace / zpětná vazbaRegulace / zpětná vazba v transdukci signálu gp130 cytokinů Negativní zpětná vazba aktivace gp130 signální dráhy je zprostředkována indukcí exprese proteinu SOCS, inhibice pak interakcí PIAS se STAT a defosforylací STATexprese proteinu SOCS, inhibice pak interakcí PIAS se STAT a defosforylací STAT fosfatásou Tc-PTP. Absence SOCS má v mnoha ohledech podobný účinek jako absence některého z komponetabsence některého z komponet kaskády LIF->gp130->STAT3. Wormald 2003 SOCS (supresor signálu cytokinů / suppressor of cytokine signaling) ­ jejich exprese je indukována aktivací gp130 a dráhy JAK->STAT. Asociují s JAK, inhibují tak její aktivitu a tím je zastavena fosforylace / aktivace STAT (zpětná vazba). Jednotlivé SOCS proteiny vykazují jistou specifitu pro jednotlivé gp130 signální komplexy. SOCS proteiny = CIS (cytokine-inducible SH2 protein) a SOCS1-SOCS7. IL-6 (CIS, SOCS1,2,3), LIF (CIS, SOCS1,2,3), IL-11 (SOCS3), OSM (CIS, SOCS1,3) SOCS hrají také významnou úlohu v signalizaci ostatních STATs aktivujících cytokinů zejména IFNs. Poruchy regulace exprese SOCS proteinů je často spojena s negativnízejména IFNs. Poruchy regulace exprese SOCS proteinů je často spojena s negativní prognózou u nádorových onemocnění nebo s auto-imunitními poruchami. Li 2007 PIAS (protein inhibující aktivovaný STAT) ­ asociují s fosforylovanými STAT proteiny (pravděpodobně až v buněčném jádře) a brání přímo jejich vazbě s DNA(pravděpodobně až v buněčném jádře) a brání přímo jejich vazbě s DNA nebo jako ko-represory blokují jimi zprostředkovanou transkripci. Inhibice je často spojena s degradací případně translokací STAT proteinů drahou podobnou ubiquitinaci.spojena s degradací případně translokací STAT proteinů drahou podobnou ubiquitinaci. PIAS funguje jako SUMO (small ubiquitin-related modifier) ligáza.modifier) ligáza. - PIAS1 (STAT1) - PIAS3 (STAT3) - PIASx - PIASx- PIASx - PIASy (STAT1) Rakesh, 2005 Shuai & Liu 2005 a) schematická struktura jednotlivých proteinů PIAS Shuai & Liu 2005 The SAP domain (scaffold-attachment factor A (SAFA) and SAFB, apoptotic chromatin-condensation inducer in the nucleus (ACINUS) and PIAS domain), which contains a conserved LXXLL amino-acid motifinducer in the nucleus (ACINUS) and PIAS domain), which contains a conserved LXXLL amino-acid motif (where X denotes any amino acid); the PINIT amino-acid motif, which is present in all PIAS proteins except PIASyE6­; the RLD (RING-finger-like zinc-binding domain); the AD (highly acidic domain), which contains a SUMO1 (small ubiquitin-like modifier 1)-interaction motif (red) that is found in all PIAS proteinscontains a SUMO1 (small ubiquitin-like modifier 1)-interaction motif (red) that is found in all PIAS proteins except PIASy and PIASyE6­; and the S/T region (serine- and threonine-rich region), which is also not present in PIASy and PIASyE6­ b) některé ze signálních drah interagujících s proteiny PIAS Shuai & Liu 2005 Sumarizace regulace transdukce signálů gp130 cytokinů Ernst 2004 Terapie s využitím znalostí signální transdukce gp130 cytokinůTerapie s využitím znalostí signální transdukce gp130 cytokinů a) Modulace reakcí imunitního systému, zejména útlum průběhu zánětua) Modulace reakcí imunitního systému, zejména útlum průběhu zánětu - antagonisté receptorů, inhibitory JAK a STAT aktivity b) Potlačení nádorových onemocněníb) Potlačení nádorových onemocnění - aplikace cytokinů a agonistů receptorů (leukémie), inhibitory JAK a STAT aktivity c) Potlačení neurodegenerativních onemocnění - aplikace zejména CNTF a jeho derivátů (ligand-receptor)- aplikace zejména CNTF a jeho derivátů (ligand-receptor) d) Podpora hematopoézy - aplikace cytokinů- aplikace cytokinů e) Potenciálně zvýšení úspěšnosti IVF Vysoká promiskuita mezi receptory a cytokiny (zejména při vyšších dávkách), která často vede k nežádoucím vedlejším účinkům (kachexie, zánět, vyšší citlivost k infekcím) je řešena vytvářením solubilních komplexů ligand-receptor.citlivost k infekcím) je řešena vytvářením solubilních komplexů ligand-receptor. Literatura ke studiu:Literatura ke studiu: 1. Akira, S. 1999. Functional Roles of STAT Family Proteins: Lessons from Knockout Mice. Stem Cells 17:138-146.Mice. Stem Cells 17:138-146. 2. Auernhammer, C. J., and S. Melmed. 2000. Leukemia-Inhibitory Factor-Neuroimmune Modulator of Endocrine Function. Endocrine Reviews 21:313-345. 3. Ernst, M., and Jenkins, B.J. 2004. Acquiring signalling specificity from the cytokine receptor3. Ernst, M., and Jenkins, B.J. 2004. Acquiring signalling specificity from the cytokine receptor gp130. TRENDS in Genetics. 20: 23-32. 4. Heinrich, P. C., I. Behrmann, S. Haan, H. M. Hermanns, G. Muller-Newen, and F. Schaper. 2003. Principles of interleukin (IL)-6-type cytokine signalling and its regulation. Biochem. J. 374:1-20.374:1-20. 5. Igaz, P., S. Toth, and A. Falus. 2001. Biological and clinical significance of the JAK-STAT pathway; lessons from knockout mice. Inflamm. res. 50:435-441. 6. Liu, K. D., S. L. Gaffen, and M. A. Goldsmith. 1998. JAK/STAT signaling by cytokine6. Liu, K. D., S. L. Gaffen, and M. A. Goldsmith. 1998. JAK/STAT signaling by cytokine receptors. Current Opinion in Immunology 10:271-278. 7. Metcalf, D. 2003. The Unsolved Enigmas of Leukemia Inhibitory Factor. Stem Cells 21:5- 14.14. 8. Murphy, M., R. Dutton, S. Koblar, S. Cheema, and P. Bartlett. 1997. Cytokines which signal through the LIF receptor and their actions in the nervous system. Progress in Neurobiology 52:355-378.52:355-378. 9. Rose-John, S. 2002. GP130 stimulation and the maintenance of stem cells. TRENDS in Biotechnology 20:417-419. 10. Taga, T. 1997. The signal transducer gp130 is shared by interleukin-6 family of10. Taga, T. 1997. The signal transducer gp130 is shared by interleukin-6 family of haematopoietic and neurotrophic cytokines. Ann Med 29:63-72.