Moderní metodv buněčné bioloqie - nov 1. Buněčné kultury Stanovení počtu a viability buněk: ukázka vybavení laboratoře, obsluha flow boxu, typy plastů pro buněčné kultury, bezpečnost práce, pasážování buněk, počítání částic na Coulter Counter, určení životnosti buněk barvením eosinem. Detekce apoptotických buněk: stanovení apoptotického indexu - barvení pomocí DAPI (fluorescenční detekce buněk s kondenzovaným a fragmentovaným chromatinem). Měření mitochondriálního membránového potenciálu apoptotických buněk pomocí barvení TMRE (tetrametyl rhodamin etylester) a detekce průtokovou cytometrií. Stanovení stupně diferenciace leukemických buněk: detekce povrchových molekul CD11b a CD14 u buněk myeloidní linii HL-60 průtokovou cytometrií pomocí přímé imunocytochemie s protilátkami značenými fluorescenčními barvivy. Stanovení míry oxidativního vzplanutí jako ukazatele diferenciace u buněk HL-60 za použití různých aktivátorů fagocytózy (zymosan, forbol myristat acetat, Ca2+ ionofor) na destičkovém luminometru. Stanovení diferenciace buněk nádoru kolonu (linie HT-29): stanovení alkalické fosfatázy kolorimetricky (alkalická fosfatáza štěpí bezbarvý substrát 4-p-nitrofenyl fosfát za vzniku žlutého zbarvení). 2. Fluorescenční a konfokální mikroskopie Princip funkce fluorescenčního mikroskopu (výhody a limitace), rozdíly mezi konvenční a konfokální mikroskopií. Pozorování trojrozměrně fixovaných interfázních jader, ve kterých je fluorescenčně značený gen a jinou fluorescenční značkou obarven celý chromozom, na kterém se daný gen nachází. 3. biochemické metody Příprava buněčného lyzátu pro Western blotting a izolaci RNA: metodika přípravy buněčného lyzátu pro detekci proteinů a pro izolaci RNA, stanovení koncentrace proteinů pomocí kitu Bio-Rad DC protein Elektroforéza a transfer proteinů na membránu: separace stanoveného množství proteinů připravených v rámci předchozího cvičení pomocí SDS-PAGE, přenos na PVDF membránu pomocí semidry electroblotting. Imunodetekce: imunodetekce beta-aktinu pomocí primární neznačené protilátky (anti-beta-aktin) a sekundární protilátky značené křenovou peroxidázou ve vzorcích zpracovaných a separovaných v rámci předchozích cvičení, vizualizace bude provedena pomocí kitu ECL Plus. Izolace celkové RNA, stanovení koncentrace a kvality: izolace RNA z připraveného buněčného lyzátu pomocí komerčního kitu, stanovení koncentrace RNA a její čistota na přístroji Nanodrop ND-1000 Spectrophotometer pokračuje ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) metoda: stanovení tumor nekrotizujícího faktoru alfa pomocí komerčního kitu od firmy R&D system Duoset v médiu získaného z diferencovaných myeloidních buněk THP-1 po aplikaci endotoxinu v různých koncentracích po dobu 24 hodin. asovy harmonogram cvičeni 24. 11. 2008 Teoreticky úvod: laboratoř buněčných kultur, kultivace buněk, typy buněčných kultur, měření základních parametrů cytokinetiky, vyjadřování výsledků atd apoptóza a metody její detekce, diferenciace a její detekce Praktické cvičení: seznámení s laboratoří buněčných kultur a jejím vybavením kultivace a pasážování různých typů buněčných linií detekce apoptotických buněk (stanovení apoptotického indexu - barvení pomocí DAPI a fluorescenční detekce buněk s kondenzovaným a fragmentovaným chromatinem; měření mitochondriálního membránového potenciálu apoptotických buněk pomocí barvení TMRE (tetrametyl rhodamin etylester) a detekce průtokovou cytometrií stanovení stupně diferenciace epiteliálních buněk z nádorové linie kolonu (HT-29) po indukci butyrátem sodným (NaBt) - kolorimetrické stanovení aktivity alkalické fosfatázy. 1.12. 2008 Diferenciace leukemických buněk: stanovení počtu a viability buněk myeloidní linie HL-60 detekce povrchových molekul CD11b a CD14 u buněk HL-60 průtokovou cytometrií stanovení míry oxidativního vzplanutí jako ukazatele diferenciace u buněk HL-60 za použití různých aktivátorů fagocytózy na destičkovém luminometru. ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) metoda: stanovení cytokinu - tumor nekrotizujícího faktoru alfa (TNF) pomocí komerčního kitu v médiu získaného z diferencovaných myeloidních buněk po aplikaci endotoxinu v různých koncentracích po dobu 24 hodin. 8. 12. 2008 Fluorescenční a konfokální mikroskopie - Princip funkce fluorescenčního mikroskopu (výhody a limitace), rozdíly mezi konvenční a konfokální mikroskopií. Pozorování trojrozměrně fixovaných interfázních jader - vysokorozlišovací cytometrie - Izolace celkové RNA z připraveného buněčného lyzátu pomocí komerčního kitu, stanovení koncentrace a kvality na přístroji Nanodrop ND-1000 Spectrophotometer. - přehledné seznámení s dalšími metodami (detekce exprese specifických proteinů Western blotting, elektroforéza SDS-PAGE, imunodetekce) živočišné, rostlinné, hmyzí, rybí atd. Živočišné buněčné kultury (získané z různých tkání např. hlodavců jako je myš, krysa, křeček nebo opic, člověka) PRIMÁRNÍ KULTURY - buňky získané přímo z živočišných tkání, kousek tkáně, nutná disociace (rozvolnění) buněk a odstranění nežádoucích částí, omezená doba kultivace, specifické požadavky ■ BUNĚČNÉ LINIE - adaptované na dlouhodobý růst in vitro diploidní - karyotyp identický s živočišným druhem, z něhož byly izolovány většinou omezený počet pasáží, stárnou a hynou (omezený tzv. "life-span") heteroploidní - karyotyp a často i morfologie odlišné, dlouhodobá kultivace Udržují se tzv. pasážováním - určitý počet buněk se po určité době přenese do čerstvého živného prostředí ADHERENTNÍ kultury - rostou přichyceny k pevnému podkladu (kultivační nádobky, mikronosiče) SUSPENZNÍ kultury - nevyžadují podklad, rostou volně v médiu Hlavní komerční dodavatelé buněčných linií The American Type Culture Collection (ATCC) httD://www.atcc.com/ The European Collection of Cell Cultures (ECACC) htto://www.ecacc.or2.uk/ Product Storage Unit Size I «780 93112519 ■ec/es: human Issue ovary I epithelial mjbculture Methods: Split sub-confluent cultures (70-80%) 1:3 to 1:6 i.e. seeding at 3-6 x 104 cells/cm2 using 0.25% trypsin or trypsin/EDTA; 5% C02; 37 °C. Itert.-. RPMI 1640 + 2 mM L-Glutamine + 10% Fetal Bovine Serum (FBS). mryotype: Not specified mcription: The A2780 human ovarian cancer cell line was established from ■jmor tissue from an untreated patient. Cells grow as a monolayer and in suspension in spinner cultures. A2780 is the parent line to the cisplatin resistant cell [line A2780 cis (ECACC catalog no. 93112517) and the adriamycin resistant cell line A2780 ADR (ECACC catalog no. 931 12520). | Shipped on dry ice 2780cis 93112517 toe human psst/e; ovary brphology. epithelial jbculture Methods: Split sub-confluent cultures (70-80%) 1:5 to 1:20 i.e. seeding ■at 1 x 103 to 1 x 104 cells/cm2 using 0.25% trypsin or trypsin/EDTA; 5% C02; 37 °C. tells will attach slowly after resuscitation and take up to 7 days to reach conflu-lency. Recommendation: resuscitate cells in media without cisplatin. Add after [subculture of attached cells. medium: RPMI 1640 + 2 mM L-Glutamine + 1 urn cisplatinum + 10% Fetal ■ovine Serum (FBS) (cisplatinum only necessary every 2-3 passages). Karyotype: Modal no. 46 wpescnptiou This cisplatin-resistant cell line has been developed by chronic expo-pure of the parent cisplatin-sensitive A2780 cell line (ECACC catalog no. 193112519) to increasing concentrations of cisplatin. A2780cis is cross-resistant Ito melphalan, adriamycin and irradiation. An increased ability to repair DNA damage as well as cytogenetic abnormalities has been observed. In order to retain resistance cisplatinum has to be added to the media every 2-3 passages. In addition to this matched pair of drug-sensitive/resistant cell lines an adri-amycin-resistant cell line, A2780adr (ECACC catalog no. 931 12520), has been isolated from the same parental line A2780. fchipped on dry ice___________ A431 85090402 ISpec/e human tissue: skin morphology: epithelial mjbculture Methods: Split sub-confluent cultures (70-80%) 1:3 to 1:6 i.e. seeding at 2-4 x 104 cells/cm2 using 0.25% trypsin or trypsin/EDTA; 5% C02; 37 °C. medium. EMEM (EBSS) + 2 mM L-Glutamine + 1% Non Essential Amino Acids l(NEAA) + 10% Fetal Bovine Serum (FBS). IKaryotype: Hypertriploid {Description Derived from an 85 year old female with epidermal carcinoma. JThe cells carry large numbers of EGF binding sites and is an indicator cell for lanti-TGF binding. I Shipped on dry ice I-196-C 1 vial I-196-CI 1 vial l-196'Cl 1 vial BUN Speciální plastikové lahvičky, misky různé velikosti - sterilní Kultivace v živném médiu podle růstových a metabolických požadavků buněk v termostatu s řízenou atmosférou - 370 C, 95% vlhkost, 5% CO Nutná přísná sterilita!!!! - sterilní roztoky, plastik. nádobky, sklo, pipety atd., sterilizace autoklávem (120 0C), nebo horkým vzduchem (180 0C) Práce ve sterilním laminárním boxu (typ BioHazard - laminární proudění vzduchu, filtry -chrání i uživatele - práce s nebezpečnými viry apod.) Základní médium je balancované chemické prostředí - zdroj pro energii a biosyntézu. Doplňky: a) nedefinované složky - zvířecí séra (hovězí, telecí, fetální, koňské) b) definované složky (růstové faktory, hormony atd.) - specializované podle typu buněk Živočišná séra nejdražší součást média - ze zvířat z ekologicky málo poškozených oblastí vhodné definované náhrady sér Antibiotika a antimykotika penicilin + streptomycin, gentamicin (i proti mykoplazmatům) Suspenzní buňky - po spočítání buněk se část supenze doplní čerstvým kultivačním médiem Adherentní (přisedlé) buňky - uvolnění od podkladu a rozvolnění shluků enzymy např. trypsinem, spočítání buněk, vysetí do čerstvého média Některé buňky vyžadují tzv. feeder layer - vrstvu buněk inaktivovaných zářením nebo chemicky sloužící jako podklad pro růst specifických typů buněk Kultivace ve sterilních plastikových lahvičkách se šroubovacími uzávěry nebo v miskách různé velikosti. Velkokapacitní kultivace - na mikročásticích ve velkých kontejnerech automatická výměna média Uchovávání buněk v hlubokozmrazeném stavu (-180 0C - mraznice, tekutý dusík) ve speciálních ampulích a kontejnerech několik let. Nutné kryoprotektivum (proti tvorbě krystalů vody) - většinou dimetylsulfoxid nebo glycerol. Zmrazování je pomalé (řízené po 1 0C), rozmrazování rychlé ponoření ampulí do lázně 37 0C. Buněčné kultury se staly nástrojem pro detekci a objasňování mechanismů účinků buněčných regulátorů a genů, které určují individuální aspekty chování buněk. Tato technologie umožnila pokrok ve virologii, somatické buněčné genetice, endokrinologii, toxikologii, farmakologii, hematologii, imunologii i ve výzkumu karcinogeneze a stala se významným nástrojem vývojové biologie, komplexní tkáňové fyziologie a průmyslové výroby specifických buněčných produktů. Výhody: ► lze sledovat účinky různých faktorů a mechanismy studovaných dějů bez nežádoucí interakce s buňkami jiných typů nebo tkání, účinku humorálních faktorů i celkového stavu organismu ► lze získat rozsáhlé populace buněk shodných vlastností a sledovat jejich reakce v kontrolovatelných podmínkách ► homogenita, reprodukovatelnost a množství materiálu umožňuje studovat a odhalovat základní mechanismy vybraných aspektů chování těchto buněk ► specifické buněčné kultury lze využít k produkci a získávání množství důležitých biologických látek (enzymy, hormony) - hybridomy ► etické hledisko - systém omezuje využívání laboratorních zvířat Nevýhody: ► umělý zjednodušený systém ► poznatky nelze beze zbytku aplikovat na podmínky in vivo Buňky nezralé (nediferencované nebo částečně diferencované) ► buňky kmenové (toti- nebo pluripotentní) ► buňky progenitorové Jsou schopny sebeobnovy, mohou se dále dělit a diferencovat do zralejších stádií Charakteristické pro embryonální stadium a v dospělém organismu pro některé tkáně (krevní tkáň, střevní a kožní epitel, zárodečné buňky) Schopné kultivace a dozrávání in vitro ve specifických podmínkách Buňky zralé - diferencované Rozrůzněné podle typu tkáně se specifickými vlastnostmi. Nejsou schopny se dále dělit, stárnou a umírají apoptózou (nervové, jaterní buňky apod.) Schopné kultivace in vitro omezený počet pasáží (diploidní stav) nebo se z nich vytvářejí heteroploidní permanentní linie. Buněčné populace in vitro Imortalizované nádorové linie asynchronní - buňky se nacházejí v různých fázích buněčného cyklu - přirozený stav synchronní - buňky jsou ve stejné fázi buněčného cyklu - uměle navozené různými chemickými látkami, homogenní populace, stejné reakce Využití: při výzkumu dějů vázaných na určitou fázi buněčného cyklu v praxi v nádorové terapii (léčba cytostatik krevní bunky I primární - z krve nebo kostní dřeně člověka a laboratorních zvířat detekce jednotlivých typů a počtů na hemocytometru kultivace progenitorů in vitro - BFU-E, CFU-S, GM-CFU - vyžadují specifické podmínky a specifické růstové faktory (erytropetin, GM-CSF, IL-3 apod.) Využití při transplantacích - namnožení buněk permanentní línie - z krve leukemických pacientů nebo lab. zvířat HL-60 - lidská promyelocytární leukémie - promyelocyty schopné diferencovat in vitro - bipotentní, deficientní v p53 kys. retinová (RA), DMSO - diferenciace do granulocytů vit. D3., forbol ester (TPA), butyrát - diferenciace do monocytů-makrofágů Vhodný model pro ► studium regulace proliferace, diferenciace a apoptózy myeloidních buněk ► studium příčin leukemických poruch ► studium účinků kyseliny arachidonové (AA), eikosanoidů a cytokinů (TGF-b a TNFoc) Při diferenciaci se mění morfologie buněk (mikroskopická detekce na preparátech z cytocentrifugy) stoupá aktivita specifických enzymů (např.nespecifické esterázy) stoupá exprese specif. povrchových antigenů (CD11b, CD 14) - FCM vzniká schopnost fagocytózy a produkce kyslíkových radikálů (měření redukce NBT nebo chemiluminiscenčně) U937 - promonocytární leukémie - promonocyty schopné diferencovat do monocytů po RA, DMSO, TPA, mutovaný p53 ML 1 - lidská myeloidní leukémie - normální (wild type) p53 z adenokarcinomu kolonu - línie HT29, CaCO2, HCT115 - nádorové buňky , FHC - fetální střevo - nenádorové. Schopnost diferencovat in vitro po působení butyrátu sodného (NaBt): ► růst aktivity alkalické fosfatázy ► morfologické změny doprovázené polymerizací F-aktinu ► zvýšení exprese adhezívních molekul - E-kadherinu Vhodný model ► pro studium regulace prolif., dif. a apoptózy epitelu střeva a mechanismů vzniku nádorů kolonu ► pro studium účinků nenasyc. MK a cytokinů Pro ekotoxikologické studie jsou vhodné ► buňky z kůže - keratinocyty - línie HaCaT - normální buňky s aktivním metabolismem AA a citlivé k působení cytokinů ► jaterní buňky: primární hepatocyty (krysí), línie nádorových buněk hepatomu (lidského nebo hlodavců), krysí jaterní fibroblasty ► geneticky modifikované buněčné línie: pro detekci dioxinové aktivity (H4IIELuc) pro detekci estrogenní aktivity (MCF-7, MVLN) studovaných látek Vnesený gen s luciferázou - intenzita odráží aktivaci příslušných vnitrobuněčných receptorů (AhR nebo ER) a je detekována na luminometru Linie lidských epiteliálních buněk kolonu FHC HCT-116 nediferencující invazívní CaCo-2 SW 620 - lymf. uzlina VYB r BAVENI LABORATOŘE PRO KULTIV ► Sterilní prostředí - speciální plastik, sklo, pipety (skleněné, automatické -různé objemy autokláv, horkovzdušná sterilizace (130 oC) ► Klimatizace, UV světlo ► Destilační přístroj na superčistou vodu ► Laminární box (Biohazard) - laminární proudění vzduchu, filtry - sterilní prostředí pro práci, ochrana při práci ► Inkubátor -37 oC, 5% CO2, 95% vlhkost ► Počítač částic (buněk) ► Inverzní mikroskop ► Centrifugy ► ELISA reader ► Cytocentrifuga ► Fluorescenční mikroskop ► Vysokoobrátková chlazená centrifuga (výměnné rotory) ► Průtokový cytometr (FACSCalibur, Beckton Dickinson) lasery, 4 fluorescence, sortovací modul stanovení několika parametrů současně u rozsáhlých buněčných populací ► Fluostar - multifunkční přístroj - spektrofotometr, fluorimetr, chemiluminometr ► Zařízení pro molekulární biologii ► Výkonná výpočetní technika Řada druhů - vhodné podle typu buněk (Eaglovo, Dulbecco, RPMI-1640), dodávají se kompletní tekutá, koncentráty, prášková - skladování 40 C. Nutná kvalitní apyrogenní voda o vodivosti 0,2-0-1 jmS a chemikálie nejvyšší čistoty. Nutná sterilizace přes filtr 0,2 mm. Základní složky: Glukóza (nebo galaktóza) a glutamin - zdroj energie a uhlíku Aminokyseliny - zdroj energie a dusíku Vitamíny - kofaktory pro enzymatické reakce Lipidy - esenciální mastné kyseliny, cholesterol, etanolamin apod Anorganické soli - zajišťují osmolalitu, tlumí aciditu, nutriční faktor Pufrační solné směsi - Earlův roztok (fyziolog. roztok s vysokým obsahem NaHCO3) - kultivace v řízené atmosféře s regulovaným obsahem 5% CO2 zabraňuje rozpadu a alkalizaci média. Požadované pH většinou 7,2 - 7,4 - úprava HCl a NaOH Otevřený systém - Petriho misky nebo lahvičky s povoleným uzávěren Optická kontrola - indikátor fenolová červeň Organické pufrační systémy - HEPES 20mM ■Cell Culture Media Classic Media: Media Formulations omponent R0883 [1x] g/L R 1145 [10x] g/L R 1383 g/L R 6504 g/L R 8758 [1x] g/L Rnorganic salts Calcium Nitrate • 4H20 0.1 1.0 0.1 0.1 0.1 Magnesium Sulfate (anhydrous) 0.04884 0.04884 0.04884 0.04884 0.04884 Potassium Chloride 0.4 4.0 0.4 0.4 Sodium Bicarbonate 2.0 — 6.0 — 2.0 Sodium Chloride 6.0 60.0 6.8 6.0 6.0 Sodium Phosphate Dibasic (anhydrous) AMINO acids 0.8 8.0 0.8 0.8 0.8 L-Arginine 0.2 2.0 0.2 0.2 0.2 L-Asparagine (anhydrous) 0.05 0.5 0.05 0.05 0.05 L-Aspartic Acid 0.02 0.2 0.02 0.02 0.02 L-Cystine • 2HCI 0.0652 0.652 0.0652 0.0652 0.0652 L-Glutamic Acid 0.02 0.2 0.02 0.02 0.02 L-Glutamine — — 0.3 0.3 0.3 Glycine 0.01 0.1 0.01 0.01 0.01 L-Histidine 0.015 0.15 0.015 0.015 0.015 Hydroxy-t-Proline 0.02 0.2 0.02 0.02 0.02 L-lsoleucine 0.05 0.5 0.05 0.05 0.05 L-Leucine 0.05 0.5 0.05 0.05 0.05 L-Lysine • HCl 0.04 0.4 0.04 0.04 0.04 L-Methionine 0.015 0.15 0.015 0.015 0.015 L-Phenylalanine 0.015 0.15 0.015 0.015 0.015 L-Proline 0.02 0.2 0.02 0.02 0.02 L-Serine 0.03 0.3 0.03 0.03 0.03 L-Threonine 0.02 0.2 0.02 0.02 0.02 L-Tryptophan 0.005 0.05 0.005 0.005 0.005 L-Tyrosine • 2Na • 2H20 0.02883 0.2883 0.02883 0.02883 0.02883 L-Valine VITAMINS 0.02 0.2 0.02 0.02 0.02 D-Biotin 0.0002 0.002 0.0002 0.0002 0.0002 Choline Chloride 0.003 0.003 0.003 0.003 0.003 Folic Acid 0.001 — 0.001 0.001 0.001 myo-lnositol 0.035 0.35 0.035 0.035 0.035 Niacinamide 0.001 0.01 0.001 0.001 0.001 3-Amino Benzoic Acid 0.001 0.01 0.001 0.001 0.001 D-Pantothenic Acid (hemicalcium) 0.00025 0.0025 0.00025 0.00025 0.00025 Pyridoxine • HCl 0.001 0.01 0.001 0.001 0.001 Riboflavin 0.0002 0.002 0.0002 0.0002 0.0002 Thiamine • HCl 0.001 0.01 0.001 0.001 0.001 Vitamin B12 0.000005 0.00005 0.000005 0.000005 0.000005 DTHER D-Glucose 2.0 20.0 ■ ,: 2.0 2.0 Glutathione (reduced) 0.001 0.01 0.001 0.001 0.001 Phenol Red • Na 0.0053 0.053 0.0053 0.0053 0.0053 add L-Glutamine 0.3 0.3 at 1x — — — Sodium Bicarbonate — 2.0 at 1x 2.0 2.0 M6CÜ3 Classic Media: Media Formulations Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DME) _ _ D 5523 D 5546 D 5648 D 5671 D 5796 Component g/L tlx] g/L g/L [1x] g/L [1x] g/L INORGANIC SALTS Calcium Chloride • 2H20 0.265 0.265 0.265 0.265 0.265 Ferric Nitrate • 9H20 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 Magnesium Sulfate (anhydrous) 0.09767 0.09767 0.09767 0.09767 0.09767 Potassium Chloride 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 Sodium Bicarbonate — BJBJPJHBHHI — 3.7 ■ Sodium Chloride 6.4 6.4 6.4 6.4 6.4 Sodium Phosphate Monobasic (anhydrous) — 0.109 0.109 0.109 0.109 AMINO ACIDS L-Arginine • HCl 0.084 0.084 0.084 0.084 0.084 L-Cystine • 2HCI 0.0626 0.0626 0.0626 0.0626 0.0626 L-Glutamine 0.584 0.584 — .0 -. 0.584 0.584 Glycine 0.03 0,03 0.03 0.03 0.03 L-Histidine • HCl • H20 0.042 0.042 0.042 0.042 0.042 L-lsoleucine 0.105 0.105 0.105 0.105 0.105 L-Leucine 0.105 0.105 0.105 0.105 0.105 L-Lysine • HCl 0.146 0.146 0.146 0.146 0.146 L-Methionine 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 L-Phenylalanine 0.066 0.066 0.066 0.066 0.066 L-Serine 0.042 0.042 0.042 0.042 0.042 L-Threonine 0.095 0.095 0.095 0.095 0.095 L-Tryptophan 0.016 0.016 0.016 0.016 0.016 L-Tyrosine • 2Na • 2H20 0.10379 0.10379 0.10379 0.10379 0.10379 L-Valine 0.094 0.094 0.094 0.094 0.094 VITAMINS Choline Chloride 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 Folic Acid 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 myo-lnositol 0.0072 0.0072 0.0072 0.0072 0.0072 Niacinamide 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 D-Pantothenic Acid (hemicalcium) 0,004 0.004 0.004 0.004 0.004 Pyridoxal • HCI 0.004 0.004 — 0.004 — Pyridoxine • HCI — 5? — 0.004 — 0.004 Riboflavin 0.0004 0.0004 0.0004 0.0004 0.0004 Thiamine • HCI 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 OTHER D-Glucose 4.5 1.0 1.0 4.5 4.5 Phenol Red • Na 0.0159 0.0159 0.0159 0.0159 0.0159 Pyruvic Acid • Na — 0.11 0.11 — — ADD L-Glutamine — — 0.584 — — Sodium Bicarbonate 3.7 3.7 — 3.7 — Sodium Phosphate 0.109 — — — — Animal Sera Product Testing for Fetal Bovine Sera 1 F 2442 F 0643 F 3885 F 4135 F 3018 F 0392 SOURCE bovine bovine bovine bovine bovine bovine COUNTRY USA USA USA USA USA USA STERILITY / / / / S / PERFORMANCE / / / / / / CLONING ASSAY ✓ / / / VIRUS (raw material) / / / / / / MYCOPLASMA / S / / S BACTERIOPHAGE / N/A / / N/A N/A ENDOTOXIN (EU/ml) <10 <10 <10 <10 <10 <10 HEMOGLOBIN (mg %) <20 <20 <20 <20 <20 <20 TOTAL PROTEIN (g %) 3.0-4.5 3.0-4.5 3.0-4.5 3.0-4.5 3.0-4.5 3.0-4.5 ELECTROPHORECTIC PATTERN / / / / / / igG / N/A N/A N/A N/A N/A HORMONE TESTING Report result N/A Report result Report result N/A N/A pH at RT 6.7-8.0 6.7-8.0 6.7-8.0 6.7-8.0 6.7-8.0 6.7-8.0 OSMOLALITY (mOsm/Kg H20) 260-340 260-340 260-340 260-340 260-340 260-340 CHEMICAL ANALYSIS / N/A / / N/A N/A / — Indicates testing is performed and product meets specification. Scientific interests ► Lipid dietary compounds in regulation of cytokinetics ► Growth regulators in cancer cell signalling ► Interaction of lipids and cytokines ► Effects of anticancer drugs ► Molecular and cellular mechanisms of toxicity of organic compounds Laboratoř cytokinetiky BFU (hlavní oblasti výzkumu a odborného směřování) laboratoř ytokinetiky Biofyzikálni Oslov DVČIt, AftNO - Používané modely a metodický potenciál - Příklady výsledků s využitím tkáňových kultur - Některá úskalí, klady a omezení modelů in vitro studium na jednotlivých úrovních organizace systému CLaboratoř ytokinetiky ftiofyzikální ústov AVČA, AANO TOXICOLOGY ECOTOXICOLOGY - aboratory ytokinelics experimental base J REGULATION OF CELL KINETICS (PROLIFERATION, DIFFERENTIATION, APOPTOSIS 1 - molecular level 2 - cellular level 3 - systemic level (organism, population, ecosystem) VÝZKUMNÉ CÍL A TI PRAKTICKÉH O VYUŽIT POPULACE NORMÁLNÍCH (NETRANSFORMOVANÝCH) BUNĚK „cell signalling" (cytokiny vs. eikosanoidy) POPULACE ITRANSFORMOVANÝCH BUNĚK v oboroloř ytokinetiky niofyzikólnf ústav AVČA, AANO Užití Výroba Výzkum (vývoj) m Aplikovaný (cílený) Základní Snaha o naplnění cyklu a důsledky pro finanční zajištění ^^^h ylokinelikv ftiorv'ihälní ústav nvČR. BRNO DETEKCE PROLIFERACNI AKTIVITY BUNĚK Růst buněk počty buněk (Burkerova komůrka, Coulter Counter) v časových intervalech od vysetí určitého počtu - růstové křivky spektrofotometrické stanovení celkových proteinů - Amido black doba zdvojení populace (doubling time), generační doba (trvání buněčného cyklu) Metabolický aktivní část populace izotopové metody - stanovení podílu populace syntetizující DNA - inkorporace 3H-tymidinu do DNA - detekce hladiny radioaktivity autoradiograficky nebo scintilačně detektor b záření spektofotometrické metody - inkorporace bromdeoxyuridinu - detekce pomocí navázané protilátky - ELISA reader nebo průtoková cytometrie (FCM) metoda redukce MTT na formazan - založeno na aktivitě mitochondrií Stanovení mitotického indexu mikroskopické stanovení podílu buněk v mitóze na řezech z tkání či buněčných preparátech Detekce počtu buněk v jednotlivých fázích buněčného cyklu Flow cytometrie - procento buněk v G0/G1, S a G2/M fázi Stanovení délky fází buněčného cyklu - autoradiografické metody, BrDU Testy cytotoxicity MTT test Stanovení viability - vitální barvení trypanovou modří nebo eosinem Detekce apoptózy/nekrózy Morfologicky -světelný mikroskop Fluorescenční mikroskop Flow cytometrie (AnnexinV, TUNEL, subG0/G1 populace) TRYPAN BLUE diagram i STANDARD HEMOCYTOMETER CHAMBER ■he circle indicates the approximate area covered at 100x pnicroscope magnification (10x ocular and 10x objective), dude cells on top and left touching middle line (0). Do not count cells touching middle line at bottom and right (0). Count 4 corner squares and middle square in both chambers (one chamber represented here). DIAGRAM II CORNER SQUARE (ENLARGEMENT) =9= zBz -0- Count cells on top and left touching middle line (0). Do not count cells touching middle line at bottom and right (0). ► Na počátku stojí pracovní hypotéza, kterou ověřujeme ► Důležité jsou časové a koncentrační závislosti (dose-response) ► Studium působení jednotlivých faktorů nebo jejich kombinací (multivariační analýzy) ■ ► Souvislost proliferace, diferenciace a apoptózy na buněčné úrovni ► Po stanovení základních cytokinetických dat studium detailnějších mechanismů účinků na subbuněčné a molekulární úrovni i ► Experimenty se opakují nezávisle nejméně 3x (v případě nejasností i vícekrát) a v mnoha případech zahrnují ještě paralelní měření, která upřesňují získanou hodnotu. ► Výsledky jsou vždy statisticky zhodnoceny a je určena významnost rozdílů. ► Výsledky jsou prezentovány formou tabulek, grafů nebo reprezentativních obrázků či fotografií. Příklady výsledků s využitím buněčných linií f Laboratoř ^toytokinetiky ftiofyzikální ústav IIVČR, URNO Růstové křivky 16 0 1-—- 0 24 43 7 2 144 168 Time of treatment [h] Figure 1. Effect of NaBt (5 mM) on growth of HT-29 and FHC cells (starting densityxl(f/ml). The values are means ±SEM of three independent experiments. 0 24 48 72 96 0 24 48 72 96 HOURS HOURS Figure 3. Growth of HS578T (A) and U937 (B) cells cultivated in the absence (diamonds) or in the presence of 50 /imol/1 PIROX (squares), 25 /miol/1 NDGA (circles) or 50 /xmol/l ESCUL (triangles). The solid lines and solid symbols represent nonirradiated cells. The dashed lines and open symbols represent cells irradiated with 5 Gy. The data are means ± S.E.M. for three independent experiments performed in triplicates. FIGURE 5. Number of cells and proportion of cells in cell cycle phases as influenced by combined all-frans-retinoic acid (ATRA) and proadifen (PRO) during the experimental 24- to 96-h period. The points represent the means of 3-8 independent experiments supplied with standard errors (error bars). 3000 f" 2500 FT** Z 2000 g 1500 ^ I 1000H O 500 BM2 Hours 3000 i E 2500 Is ■5 2000 g 1500 i 1000 1 500 o BM2VJUN Hours 3000 1 2500 r 2000 g 1500 J3 E = 1000 0) u 500 0 BM2cJUN Hours □ EtOH QMK886 E3ETYA □ NDGA BEsc Fig. 4. Jun proteins and lipoxygenase inhibitors slow down proliferation of BM2 cells. The same number of BM2, BM2vJUN and BM2cJUN cells was seeded and treated with zinc chloride (1.5 x 10~4 M). Four hours later, lipoxygenase inhibitors MK886, ETYA, NDGA and esculetin (Esc) (5 u,M) were added to cultivation media for indicated time. Total cell number was determined using cell counter. Columns represent the average values from three to six independent experiments. Error bars indicate standard deviations. Koncentrační závislosti (dose-response) FIGURE i. Dose-response profiles of the individual cell parameters based on concentration of all-frans-retinoic acid (ATRA) and proadifen (PRO) as independent variables. The points represent the means of 3-10 independent experiments supplied with standard enors (error bars). NBT = nitroblue tetrazolium. o *■ »* « C « O « ° 1200 i 1000 800 -600 -400 -200 - 0+| hr 0.00 i mu i 0.01 im 1 i i mím 0.10 1.00 100 n 80 60 40 -20 - 0 +| | I I MIIHI I I Mlllll f • ■ IMH| 0.00 0.01 0.10 1.00 Concentration of ATRA (liM) (Log10 scale) PRO: 0 nM PRO: 10 nM it O u. ** — & 9 o ° c.° O \° I- ° 4> C E s V- c £o S Š? > s 120 -i 100 ■ 80 - 60 - 40 - 20 - 0 +1 ŕ'1 '"""i » i tímu i'-i'iVwm 0.00 0.01 0.10 1.00 Concentration of ATRA (liM) (Log,0 scale) ....... vs- PRO: 5 [iM PRO: 15 uM FÍG LÍR E 2. The effect of all-/rans-retinoic acid (ATRA) and proadifen (PRO) on the studied cell parameters expressed as model predictions {lines) supplied with experimental points representing the means of 3-10 independent experiments. NBT = nitroblue tetrazolium. vyjádření v % kontroly (neovlivněná populace=100%) C5 1,4- | S O 1,2- 0 1 - 0,8- X! E 0,6- 2 0,4- u 0,2- > - I—I re 3 0- —a— MK886 ETYA esculetin NDGA 0,0 1,0 t-1-1-r 2,5 5,0 10,0 20,0 40,0 Concentration (liM) Fig. 1. Esculetin and NDGA negatively regulate growth of BM2 cells. The cells were cultivated in the presence of lipoxygenase inhibitors or ethanol solvent in indicated concentrations for 3 days. Total cell number in each sample was determined using cell counter. The curves represent the average numbers from three independent experiments. Error bars indicate standard deviations. BM2 cells treated with the amount of ethanol solvent corresponding to 40 |xM concentration of inhibitor were used as a reference sample. I I OGy ^ IGy ■1 5Gy --- NDGA ESCUL Figure 4. 3H-thymidine incorporation (% of nontreated control) in HS578T and U937 cells subjected to different treatment. The nonirradiated cells or cells irradiated with 1 or 5 Gy were cultivated in the presence of 25 ^mol/1 NDGA. 25 //mol/1 ESCUL (inserts 3 a, b) or 50 pmo\/\ ESCUL or without the agents (---) for 72 h. Data are means ± S.E.M. for three independent experiments performed in six parallels. * p < 0.05; ** p < 0.01 significance of the interactive component (A ■ Mi "O 0» J2 o ~~* E c 1200 1000 800 600 400 200 * fT71 cei 1 number ■ íl * celt viability * * X , * ' * * .' : * * ■ . ľ - ■ H- -+- 90 80 70 ~ 60 - IM 50 = 40 .2 > 30 = 20 w 10 0 0 0.5 5 10 15 30 concentration of TNF-a (ng/ml) Figure 1. Growth and viability of HT-29 cells after 120-hour-treatment with TNF-a. P<0.05 versus untreated control; (*) Tukey or(+) LSD test. A2780 A2780ciS CO > > 13 w "3 o 120 -i 100 - Cisplatin: IC50 = 1.34nM ICgo = 6.17nM LA-12: IC50 = 0.22 (iM IC90 = 1.00 mM 0.01 0.1 1 10 100 Concentration [uM] 1000 co > 3 CO 4> O 120 100 -■ Cisplatin: ic50 = 24.23 (iM icgo = 48.07 uM =a-12: ic50= 1.40 mM 2.65 MM 0.01 0.1 1 10 100 1000 Concentration [uM] Fig. 2. Time- and dose-response effects on the survival of A2780 and A2780cis cancer cell lines. The effects after 72 h exposure to cisplatin or LA-12 in a concentration range between 0.3 |xM and 256 jjlM were determined by MTT assay. The calculated drug concentrations inhibiting metabolic activity of cells by 50% (IC50) and 90% (IC90J are displayed for both derivatives. The results are expressed as mean ± standard deviations (S.D.) of at least three independent experiments; all concentrations were tested in three replicates. PARAMETRY BUNEČNÉHO CYKLU A2780 UNTREATED CONTROL CISPLATINCSO) LA-12(50* GG/G1; 43.5 + 2.5% ■ i i: í ■ GÔ/G1;2t$±4,1 % (*) S; 35.2 ± 4.3 % G0/G1: 27.6 ±3.5% O S; 48.12 ± 7,4%{#) G2/M: 23.12±5.4%(#) j. M,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, í - ■ G07G1: 45.5 ±6.4% S; 24.5 i 6.3 % G2^M; 24.016.7% C) ..... A G0/G1: 54,1±6,5% S: 29.8 ± 5.4 % G2/M: 21.32 ±1.5% ■ ! i! - GO/G 1:45.5 ±6-4% H f S; 33.2 ±3.1 %(•) 8.6% G0/G1:54,11 ± &5%í*) S: 29,3 ± 3.4 % (*} G2/M: 16.6 ±3.2% DNA FLUORESCENCE Figure 2. Representative results of flow cytometric analysis of the cell cycles of U937 and HS578T cell lines after 24 h of cultivation. Cells were treated with 25 fimo\/\ NDGA, 50 fimo\/\ ESCUL, or irradiated with 5 Gy. GOGI-phase ndga S-phase MK8S6 20 30 40 50 Esc EtOH 70 60 10 20 70 60 90 G2/M-phase ndga EtOH |DBM2 E3BM2V/JUM BBMZcJUN | 10 20 30 40 SO 60 Cell Number (%) Fig. 5. The effects of lipoxygenase inhibitors on cell cycle of BM2 cells expressing v-jun or c-jun. BM2, BM2vJUN and BM2cJUN cells were treated with zinc chloride and lipoxygenase inhibitors (5 \\M) or ethanol solvent (EtOH) for 1 day. Harvested cells were fixed and stained with propidium iodide. DNA content in individual cells was determined by flow cytometry. The bars represent the average values from three independent experiments. Error bars indicate standard deviations. T3 u 1 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 SG0/G1 SIS DG2/M 0 0.5 10 15 30 concentration of TNF-a (ng/ml) Figure 2. Cell cycle ofHT-29 cells after 96-hour-treatment with TNF-a. (*) P<0M5 versus untreated control for Tukey test. Control ATRA TNF-a 0 ng/ml TNF-a 10 ng/ml TNF-a 0 ng/ml 16 h 4.1 % 48 + 16 h i,-1 I 16 h 48 + 16 h 5.4 % I-1 T*" 'it ito ito zk s> j 24.5 % 1-1 - 1 1 0 30 100 1» 30C 250 FL2-A 16 h 5.4 % I-1 w i 50 1 it" lit sio at *-^ 5 ,1 i 0 90 tOO W 200 230 AM 4.4 % IS lid 260 3? 3. 5.2 % I-1 o yt m iro 200 230 47.2 % i 7.3 % 1 | 1 1 12.2 % 1 6 lid " lit " 200 R.2-A DMSO 48 + 16 h 96 + 16 h 4.2 % I I I I I,.......I ;t 100 ISO 2» 290 9.6 % I-1 si 100 'ltd 26c FL2-A TNF-a 10 ng/ml 57.6 % »8 1 44.4 % 100 1» 200 250 R.2-A & "idd lid ' 200 FL2-A. I-1 36.5 % 0 » 1» ISO 2M Fig. 2. Representative DNA content analyses (n — 3) for HL-60 cells treated with DMSO or ATRA. and TNF-a. Cells were stained and analyzed in Materials and Methods, y-axis, counts; .v-axis, PI staining. Gates denote subdiploid fraction. EXPRESE PROTEINU (WESTERN BLOTTING) Interakce kys. arachidonové (AA) a dokosahexaenové (DHA) s butyrátem pro- caspase-3 PARP Bax Bak Mcl-1 2 * 8 z NaBt - NaB o V) o V) o o AA AA •> * kDa 32 113 89 24 42 Institute of Biophysics, Brno Rcodamy of Sciences Czech Republic A2780 A2780cis (a) PARP 24 h 48 h 72 h (b) p53 24 h 48 h 72 h ft fflf Pi g :llf: 113kDa 89 kDa 113kDa 89 kDa 113 kDa 89 kDa 53 kDa 53 kDa 53 kDa (c) A2780 A2780cis control o 1«' LA-12 (50) <3 > o ^. w conirol n 3 a 5' S » r Z, > r * *■ "— N> 24h 1 3. l± 0.8* 4.6± 1.4* 1.6± 0.1 2. 3± 0.8* 24h 1 6.2± 1.1* 8.2* 1.0* 2.5* 0.2e 2.8* 0.9' 48h 1 4. t± 1.4 6.8± 1.8* 2.6± 0.2 4ff± 1.9* 48h 1 6,S± 1.9* 6.9* 0.2* 3.2* 0.5* 3.4* 0.6" 72h 1 2.5* 0.6* 3.7± 0.7* ].6± 0.2 2.5± 0.6* 72h i 5.6± 2.0* 7.0* 2.8* 3.3± (1.8 .3.3* 1.0 (d) p-actin 42 kDa Fig. 8. Western blot analyses of (a) PARP (upper panel) and (b) p53 (middle panel) protein levels in A2780 (left panel) and A2780cis cells (right panel). The cells were not exposed (untreated controls) or exposed to ICsoor ICgo concentrations of cisplatin or LA-12 and harvested at 24 h, 48 h, and 72 h of sustained drug treatment. One representative experiment of at least three is presented. Table (c) contains values of p53 expression quantified by densitometry (mean ± S.D. of at least three independent experiments). The symbols (*) denote significant difference (p < 0.05) from untreated control; (#) denote significant difference (j> < 0.05) between equitoxic cisplatin and LA-12 effects. Equal loading is documented by detection of (d) (s-actin (bottom panel). Detekce buněčné diferenciace (aktivita alkalické fosfatázy, spektrofotometrie) — 70 000 o 1_ +-> g 60 000 O ^5 50 000 ä) 40 000 O * 30 000 ^20 000 10 000 CL _l < 0 ^ NaBt TNF- a □24 hours □48 hours □72 hours x XX T jfl " x XX -r 3 0.5 15 3 0.5 3 15 5 I 5 0.5 xx i xx 5 15 Znaky diferenciace indukované butyrátem NÍHO OmM ALKALINE PHOSPHATASE E-CADHERIN PROTEIN F-ACTIN (Stress fibers) EXPRESE KARCINOEMBRYONÁL ANTIGENU 11 lmM Proliferated cell Growth inhibition & arrest in G1-phase of the cell 3mM '[F 1 okinetics Detekce buněčné diferenciace (obsah F-aktinu FITC značený phalloidin- konfokální mikr.) TNF - 0 ng/ml TNF - 0,5 ng/ml TNF -15 ng/ml TNF - 30 ng/ml VÝZKUM V LABORATOŘI CYTOKINETIKY BFU AV CR Výzkum je zaměřen zejména na působení lipidových složek výživy a mechanismy působení látek lipidové povahy v kontextu jejich interakcí s fyziologickými regulátory růstu, environmentálními polutanty a vybranými farmaky. Jsou studovány procesy vedoucí ke změnám regulace buněčné kinetiky a komunikace. Získané výsledky mají význam jak pro obecné studium procesu karcinogeneze (negenotoxické mechanismy) tak pro oblast ekotoxikologie, nádorové prevence a hledání nových protinádorových terapeutických postupů. Poznatky o úloze specifických lipidových složek výživy mohou být podkladem pro optimalizaci lipidové výživy (oblast prevence a podpůrné terapie) ve spolupráci s klinickými pracovišti a výrobní sférou. Cílem je prohloubit poznání a nově definovat potenciální úlohu látek lipidové povahy zejména vysoce nenasycených mastných kyselin a jejich derivátů v mezi- a vnitrobuněčných komunikacích podílejících se na regulaci buněčného dělení, diferenciace a apoptózy. Používané metody a metodický potenciál (východiska) f Laboratoř ^toytokinetiky ftiofyzikální ústav IIVČR, (JfiNO Zavedené modely a vybrané metodické možnosti (v kooperaci) Modely Studované parametry a metodické přístupy Buňky in vitro Buněčné linie in vitro odvozené od různých typů nádorových / nenádorovvch tkání: • krvetvorné (HL-60, U937, lidské promelocytární linie) • střevní epitel (linie lidského adenokarcinomu kolonu HT-29, embryonální linie FHC) • jaterní tkáň (myší Hepa 1, nádorové krysí buňky WB-F344) 1 Fagocvtv a Ivmfocvtv: • izolované z krve myší a zdravých lidských dobrovolníků • buněčná linie myších peritoneálních makrofágů RAW 264 ÚROVEŇ BUNĚČNÁ Oxidační a antioxidační vlastnosti emulzí, změny spekter buněčných lipidů a mastných kyselin (HPLC, plynová chromatografie) Produkce superoxidového aniontu, peroxidu vodíku, hydroxylového radikálu, oxidu dusnatého a působení na PUFA, lipidy a buňky (luminometrie, fotometrie, elektrochemie) ÚROVEŇ MOLEKULÁRNÍ A BUNĚČNÁ Exprese buněčných receptoru, exprese a aktivita specifických kináz (ERK. JNK atd.) a transkripčních faktorů (PPAR. NFkB..), exprese genů a proteinů zapojených v regulaci buněčného cyklu (p21, cykliny, CDK atd.), apoptózy (proteiny Bcl2 rodiny atd.) a buněčné adheze (FAK, E-catherin, integriny atd.) - detekce pomocí elektroforetických metod, Western blottingu, PCR, fluorimetrie, multiparametrickéflow cytometrie. ÚROVEŇ buněčných POPULACÍ A TKÁNÍ Změnv cytokinetiky (proliferace, diferenciace, apoptóza) a oxidativního metabolismu (flow cvtometrie, fluorimetrie, fluorescenční mikroskopie) Extra- a intracelulární tvorba reaktivních metabolitů kyslíku a dusíku buňkami, peroxidace lipidů (luminometrie, flow cvtometrie, fotometrie. Western blotting) Akumulace triacylglycerolů v cytoplasmě buněk ovlivněných různými Laboratorní myši kmenů CBA, C57B1, nebo jejich kříženci (evenUab.potkani) 1 • změnv krvetvorbv- pokusným myším s krvetvorbou normální nebo utlumenou ionizujícím zářením či aplikací cytostatika budou podávány testované substance • nádorový růst- u pokusných myší s experimentálně implantovaným nádorem budou sledovány efekty léčby testovanými substancemi na nádorový růst • zánětlivv/septickv model- pokusným myším bude intraperitoneálně podáván endotoxin (10 mg/kg) rozpuštěný ve fyziologickém roztoku. Současně nebo následně budou podávány také studované lipidové emulze. složkami lipidových emulzí, fluidita membrán (HPLC, plynová chromatografie, fluorimetrie) Komplexní analýza krvetvorbv pokusných myší - stanovení počtů jednotlivých typů buněk v periferní krvi a krvetvorných orgánech, vyhodnocení stavu poolu progenitorových buněk pro granulocyty, makrofágy ( GM-CFC ) a erytrocyty (BFU- E ). ACSCalibu Flow cytometrie: jedna z hlavních používaných metodologií G ciborcitory ytokinetics Institute of Biophysics, Brno Academy of Sciences Czech Republic tvídům pii^iup i\ pudii^eiii lurvmeiirvy. detekce hlavních parametrů (dynamiky) a jejich ronováhy/nerovnováhy v čase differentiation apoptosis (necrosis) Vhodnost volby modelu Studie in vivo - poskytují informaci o celkové (systémové) opdpovědi organismu, relativně méně vhodné ke studiu mechanismu účinků na subbuněčné úrovni Studie in vitro - nelze z nich mechanicky zobecňovat závěry pro systémy in vivo (chybí zapojení vyšších regulačních systémů), ideální pro studium mechanismů účinků na subbuněčné úrovni Cl ■ laboratoř ^^ytokinetiky ftiofyzikální ústav AVČft, AftNO METODOLOGIE Detekce proliferace- regulace buněčného cyklu a zapojených proteinů, diferenciace -buněčná morfologie, aktivita specifických enzymů, exprese specifických proteinů apoptózy -detekce charakteristických změn na úrovni jádra, mitochondrií, membrán, cytoskeletu, exprese regulačních proteinů, štěpení specifických enzymů a substrátů ZMĚNY LIPIDOVÉHO METABOLISMU A VLASTNOSTÍ BUNĚČNÝCH MEMBRÁN -změny spektra MK v bun. lipidech, „lipid packing" v membránách, akumulace triglyceridů, detekce kardiolipinu, membránový potenciál ZMĚNY OXIDATIVNÍHO METABOLISMU - produkce reaktivních metabolitů kyslíku (ROS) a dusíku, lipidová peroxidace, účinky antioxidantů Využití moderních metod průtokové cytometrie, fluorescenční mikroskopie, fluorimetrie, spektroskopie, metod molekulární biologie... buněčné linie (tkáňové kultury) aborciloř ytokinetiky fliofyzikólní ústav flVČft, AftNO Buňky epiteliálního původu Označení Lokalizace Organismus Patologie A2780 ovarium člověk karcinom, Pt - citlivé A2780cis ovarium člověk karcinom, Pt - rezistentní A549 plíce člověk karcinom BEAS-2B plíce člověk tranformované virem CaCo2 kolon člověk adenokarcinom CCL-64 plíce norek normální CH-1 ovarium člověk karcinom, Pt- citlivé COR-L23 plíce člověk karcinom COR-L23/CP3 plíce člověk karcinom, Pt - rezistentní COR-L23R plíce člověk karcinom, doxorubicin -rezistentní CT26 kolorectum myš karcinom E10 plicní myš normální FHC kolon člověk embryonální H4IIELuc játra krysa karcinom I ■ Označení Lokalizace Organismus Patologie HaCaT epidermis člověk normální HeLa cervix člověk karcinom Hepal játra myš karcinom HepG2 játra člověk karcinom HT-29 kolon člověk adenokarcinom HT115 kolon člověk adenokarcinom HUVEC endotel člověk embryonální LEP plíce člověk embryonální (fibroblasty) MCF-7 prs člověk adenokarcinom MDA-MB-231 prs člověk adenokarcinom MDCK ledvina pes normální MVLN prs člověk adenokarcinom SKOV-3 ovarium člověk adenokarcinom, Pt - primárně rezistentní T47D prs člověk karcinom WB-F344 játra krysa normální Buňky mezenchymálního původu Označení Lokalizace Organismus Patologie G5:113 myš fíbrosarkom HL-60 krev člověk leukémie IMM nervové imortalizované Jurkat krev člověk leukémie (lymfoidní) K562 krev člověk leukémie (erytroidní) MOLT-4 krev člověk leukémie (lymfoidní) ML-1 krev člověk leukémie (myeloidní) NB4 krev člověk leukémie (myeloidní) U937 krev člověk leukémie (monocytární) V79 fibroblasty křeček normální (fibroblasty) WEHI krev myš leukémie (lymfoidní) Přehled metod a metodologií oborciloř ytokinetiky AiofyzikoJní ústav flVČft, AftNO Metody používané v laboratoři cytokinetiky BFU AV CR, Brno Legenda: FACS - průtoková cytometric FM - fluorescenční mikroskop SM - světelný mikroskop WB - western blotting FM - fluorimetrie (FluoStar) CM - kolorimetrie (FluoStar nebo Elisa reader) LM - luminometrie (VUVEL, Lojek) PAGE - polyakrylamidová elektroforéza RT-PCR - reverse transcription polymerase chain reaction RG - radiografie ELFO - agarosová elektroforéza Metody průkazu apoptotické formy bunečné smrti Název metody, stanovované molekuly Princip, funkce, parametr Legenda DAPI staining Studium morfologických změn buněčného jádra apoptotických buněk FM Annexin V - FITC + propidium jodid (PI) Externalizovaný fosfatidylserin apop. buněk + zachovaná semipermeabilita (detekce rané apoptózy) FACS, FM TUNEL + PI Průkaz specifické fragmentace DNA (DNA zlomů - nicku - ss DNA breaks) FACS, FM SubG0/G1 peak v distribuci buněčného cyklu Barvení buněčné DNA propidium jodidem s extrakcí nízkomolekulární DNA citrátovým pufrem FACS PI - Hoechst double - stain Rozdělení buněk na mrtvé/živé, podle morfologie jádra identifikace apoptotických buněk FM DNA žebřík Průkaz fragmentace DNA na 180 bp fragmenty (tzv. ladder) ELFO Kaspáza1,3, 7, 8,9 Detekce exprese specifických proteáz WB Caspase assay (c-3, -6, -8, -9 subs.) Důkaz aktivity specifických proteáz štěpením specifické sekvence na fluorescenční substrát FM cytokeratin 18 - protilátka M30 Neoepitop vytvořený štěpením cytokeratinu kaspázou FACS, Lamin B Degradace Laminu B kaspázami WB PARP Detekce štěpení proteinu PARP WB JC-1, TMRE, DÍOC6, MitoTracker Red, Rh 123 Detekce změn mitochondriálního potenciálu A^Pm FACS Hoechst + propidium jodid (PI) Detekce apoptických, nekrotických a sekundárně nekrotických buněk (detekce i pozdní apoptózy) FM F-aktin Detekce intenzity polymerizace a depolymerizace aktinu (pomocí konjugátu faloidin-FITC) FCM, FM Intracelulární pH Průkaz poklesu intracelulárního pH vůči fyziol. hodnotě nutného k aktivaci enzymu DNA-ázy Izolace cytochromu c z cytos. frakce Vylití Cyt. C z mitochondríí do cytosolu a formování komplexu s Apaf-1 a procasp-9 vytváří apoptosom WB OxPhos Complex IV subunit II Studium funkce mitochondrií WB Proteiny a molekuly spojené s procesem apoptózy Název metody, stanovované molekuly Princip, funkce, parametr Legenda Bad, Bag-1, Bak, Bax, Bcl-2, Bcl-X, Bcl-XL, Bid, Mcl-1 Bcl-2 rodina - regulátory průběhu apoptózy WB c-FLIP Inhibitor kaspázy 8 WB c-IAP1,XIAP Rodina inhibitorů kaspáz WB Hydroethidin, 2',7' dichlorofluoresceindiacetát Stanovení respiračního vzplanutí a produkce ROS provázející apoptózu FACS Dihydrorhodamin 123 Stanovení respiračního vzplanutí a produkce ROS provázející apoptózu FACS Lucigenin Stanovení respiračního vzplanutí a produkce ROS provázející apoptózu LM Metody stanovení úrovně proliferace, cytotoxicity, viability Název metody, stanovované molekuly Princip, funkce, parametr Legenda Počítání buněk Počítač částic založený na principu konduktivity Coulter counter Dye exclusion assay - eosin, trypanová modř Barvení mrtvých buněk s permeabilizovanou membránou SM Dye exclusion assay - propidium jodid Barvení mrtvých buněk s permeabilizovanou membránou FACS MTT, WST-1 Stanovení relativního množství buněk metabolizujících tetrazolove soli MTT, WST-1 na formazanove produkty CM CyQuant Kit (Molecular Probes) pro značení DNA speciální fluorescenční barvou - proliferační assay FM PCNA Marker proliferace - podjednotka DNA-polymerázy 6 a e WB, SM Inkorporace BrdU Analog deoxyuridinu se inkorporuje během replikace DNA v proliferujích buňkách FACS, FM Inkorporace 3H-thymidinu (izotopová metoda) Triciem značený thymidin se inkorporuje do buněk během replikace DNA - scintilační hodnocení RG Clonogenic assay Otreatované buňky rostou v médiu nebo na agaru, sleduje se schopnost vytvářet kolonie buněk Metody analýzy buněčného cyklu Název metody, stanovované molekuly Princip, funkce, parametr Legenda Barvení pomocí Pl (např. Vindelův roztok) Distribuce buněčné populace podle množství celkové buněčné DNA do jednotlivých fáz bun. Cyklu FACS Mouse anti-BrdU-FITC + PI Sledování syntézy DNA na základě inkorporace BrdU do DNA proliferujících buněk FACS Pulse-chase BrdU labeling Sledování průchodu buněk cyklem FACS Proteiny spojené s regulací buněčného cyklu Název metody, stanovované molekuly Princip, funkce, parametr Legenda cyklin A Řízení S - G2 fáze b. cyklu - asociuje s cdk 2 WB cyklin D1 Řízení přechodu z fáze G1 do S - asociuje s cdk 4 WB cdk 2 activity assay Řízení S - G2 fáze b. cyklu - asociuje s cyklinem A RG cdk4 Řízení přechodu z fáze G1 do S - asociuje s cyklinem D WB p15, 16 Rodina p16 - inhibující kinázy cdk 4 a 6 WB p21/waf1/cip1/sdi1/pic1 Inhibitor cdk a DNA replikace, transaktivovaný pomocí p53 WB p27/kip1 Inhibitor komplexů cyklin D-cdk 4, cyklin A-cdk 2 WB Topoizomeráza Na Replikační faktor - marker pozdní S/G2/M fáze b. cyklu WB pRb Onkosupresor zastavující ve fosforylované formě b. cyklus v souvislosti s p21 WB p53 Tumor supresorový gen - "Guardian of the genome" - downstream reguluje p21/waf WB Metody detekce diferencujících se buněk J Název metody, stanovované molekuly Princip, funkce, parametr Legenda CD11b, CD14 Znaky monocytární diferenciace lidských leukemických buněk FACS Nespecifické esterázy Stanovení aktivity oc-naftyl acetát esterázy (difer. leukemických buněk) CM Fagocytická aktivita Znak monocytární diferenciace leukem. buněk - pohlcení částic konjug. s FITC FACS NBT redukční test Se zvyšující se úrovní diferenciace roste počet reduk. formazánových zrn CM Aktivita alkalické fosfatázy Znak diferenciace kolonových buněk - disodná sůl 4-nitrofenyl fosfátu CM Nespecifické esterázy Stanovení aktivity nespecifických esteráz pomocí štěpení fluoresenčné sondy CFDA (karboxyfluorescein diacetát) FACS Intracelulární pH Stanovení intracelulárního pH jako markru diferenciace buněk pomocí flourescenční sondy SNARF-1 FACS Polymerizace aktinu FITC značený faloidin FM Proteiny spojené s diferenciací buněk Název metody, stanovované molekuly Princip, funkce, parametr Legenda RARoc Receptor all-trabs retinoic acid, indukující diferenciaci leukemických buněk WB RXRa Receptor aktivovaný 9-cis-retinovou kyselinou WB VDR Receptor vitaminu D, množství VDR moduluje růst a diferenciaci nádorových buněk WB I Mezibuněčná komunikace, anoikis, motilita buněk Název metody, stanovované molekuly Princip, funkce, parametr Legenda FAK Nereceptorová tyrosin kináza zapojená v přenosu signálů z ECM WB Cadheriny Složka desmosomu, nachází se v komplexu s cateniny WB, FM y-catenin Složka desmosomu, nachází se v komplexu s cadheriny WB connexin 43 Složka gap junctions (GJIC) WB GJIC inhibition assay Testování funkčnosti GJIC pomocí luciferové žluti FM Wound healing assay Testování motility buněk FM Metabolismus kyseliny arachidonové Název metody, stanovované molekuly Princip, funkce, parametr Legenda cytopl. fosfolipáza A2 Odštěpuje AA z membrán WB 5-lipooxygenáza Metabolizuje AA na leukotrieny WB Cyklooxygenáza 2 Metabolizuje AA na prostaglandiny, prostacykliny a tromboxany WB Uvolňování AA Uvolnění AA z buněk do media HPLC (VUVEL) Mgnaim arany receptoru smrti Název metody, stanovované molekuly Princip, funkce, parametr Legenda Fas-L Ligand Fas-R - signál smrti WB Fas-R (CD95) Receptor smrti - aktivovaný navázáním Fas-L WB,FACS FAD D Adaptérová molekula - součást DISC komplexu WB Toso Inhibitor Fas indukované apoptózy nacházející se na povrchu T lymfocytů WB TRAIL Ligand TRAIL-R - signál smrti WB TRAIL-R1,2(DRs) Receptory smrti - aktivovány navázáním TRAIL-L WB.FACS TRAIL-R3,4 (DcRs) Decoy receptory - vážou TRAIL, ale neaktivují proces apoptózy WB,FACS Kinazy a proteiny s nimi asociované Název metody, stanovované molekuly Princip, funkce, parametr Legenda Ras, N-Ras Mebránový G-protein WB ERK 1/2 Imunochemické stanovení neaktivní a aktivní (fosforylované formy) WB p38 Imunochemické stanovení totální (na fosforylačním stavu nezávislé) hladiny p38 WB JNK/SAPK activity assay stanovení aktivity analýzou fosforylace substrátu (radioizotopová metoda) RG Akt/PKB Serin/Threoninová protein kináza, může stimulovat Ras WB pTyr Protilátka detekující fosforylovaný Tyrosin WB pSer Protilátka detekující fosforylovaný Serin WB Signální dráha TGFp Název metody, stanovované molekuly Princip, funkce, parametr TGF p1 Růstový faktor WB TGF p R I, II Receptor pro TGF p WB Smad 2, 4 Aktivace TGF R vede k translokaci těchto transkripčních faktorů do jádra WB ■ Proteiny asociované s AhR Název metody, stanovované molekuly Princip, funkce, parametr Legenda AhR WB, RT-PCR Ligand-dependentní transkripční faktor, EMSA, FM Reportér gene assay for AhR Metoda stanovení aktivity Ah R LM Stabilní transfekce mutantních variant AhR a ARNT pomocí plazmidových vektorů ARNT Jaderný partner receptoru AhR umožňující jeho vazbu na XRE element WB, RT-PCR CYP1A1 Oxidáza se smíšenou funkcí patřící do rodiny cytochromů P450 WB, RT-PCR Proteiny spojené s hormonální regulací Název metody, stanovované molekuly Princip, funkce, parametr Legenda ER a, p Receptory estrogenů WB Reportér gene assay for ER Metoda stanovení aktivity estrogenních receptoru LM Cathepsin D Endopeptidáza indukovaná estrogeny WB LRP/MVP Ribonukleoproteinové částice ovlivněné hladinou estrogenů WB PPARy Jaderný receptor pro hormony ovlivňovaný MAPK WB Transkripční faktory a asociované proteiny Název metody, stanovované molekuly Princip, funkce, parametr Legenda NF-kB Aktivátor řady genů spojených s hematopoezou, apoptózou atd. WB, EMSA IkB Inhibitor NF-kB, který jej zadržuje v cytoplazmě WB c-Myc Po navázání heterodimerizačního partnera Max působí jako TF WB p53 Onkosupresor podílící se na řízení oprav DNA lézí WB AP -1 (Jun + Fos) Homo- či heterodimerní transkripční faktor WB, EMSA ACSCalibu Průtoková (flow) cytometrie jedna z hlavních používaných metodologií G ciborcitory ytokinetics Institute of Biophysics, Brno Academy of Sciences Czech Republic