Sylabus Moderní metody buněčné biologie – nový 1. Buněčné kultury Stanovení počtu a viability buněk: ukázka vybavení laboratoře, obsluha flow boxu, typy plastů pro buněčné kultury, bezpečnost práce, pasážování buněk, počítání částic na Coulter Counter, určení životnosti buněk barvením eosinem. Detekce apoptotických buněk: stanovení apoptotického indexu - barvení pomocí DAPI (fluorescenční detekce buněk s kondenzovaným a fragmentovaným chromatinem). Měření mitochondriálního membránového potenciálu apoptotických buněk pomocí barvení TMRE (tetrametyl rhodamin etylester) a detekce průtokovou cytometrií. Stanovení stupně diferenciace leukemických buněk: detekce povrchových molekul CD11b a CD14 u buněk myeloidní linii HL-60 průtokovou cytometrií pomocí přímé imunocytochemie s protilátkami značenými fluorescenčními barvivy. Stanovení míry oxidativního vzplanutí jako ukazatele diferenciace u buněk HL-60 za použití různých aktivátorů fagocytózy (zymosan, forbol myristat acetat, Ca^2+ ionofor) na destičkovém luminometru. Stanovení diferenciace buněk nádoru kolonu (linie HT-29): stanovení alkalické fosfatázy kolorimetricky (alkalická fosfatáza štěpí bezbarvý substrát 4-p-nitrofenyl fosfát za vzniku žlutého zbarvení). 2. Fluorescenční a konfokální mikroskopie Princip funkce fluorescenčního mikroskopu (výhody a limitace), rozdíly mezi konvenční a konfokální mikroskopií. Pozorování trojrozměrně fixovaných interfázních jader, ve kterých je fluorescenčně značený gen a jinou fluorescenční značkou obarven celý chromozom, na kterém se daný gen nachází. 3. Biochemické metody Příprava buněčného lyzátu pro Western blotting a izolaci RNA: metodika přípravy buněčného lyzátu pro detekci proteinů a pro izolaci RNA, stanovení koncentrace proteinů pomocí kitu Bio-Rad DC protein. Elektroforéza a transfer proteinů na membránu: separace stanoveného množství proteinů připravených v rámci předchozího cvičení pomocí SDS-PAGE, přenos na PVDF membránu pomocí semidry electroblotting. Imunodetekce: imunodetekce beta-aktinu pomocí primární neznačené protilátky (anti-beta-aktin) a sekundární protilátky značené křenovou peroxidázou ve vzorcích zpracovaných a separovaných v rámci předchozích cvičení, vizualizace bude provedena pomocí kitu ECL Plus. Izolace celkové RNA, stanovení koncentrace a kvality: izolace RNA z připraveného buněčného lyzátu pomocí komerčního kitu, stanovení koncentrace RNA a její čistota na přístroji Nanodrop ND-1000 Spectrophotometer pokračuje ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) metoda: stanovení tumor nekrotizujícího faktoru alfa pomocí komerčního kitu od firmy R&D system Duoset v médiu získaného z diferencovaných myeloidních buněk THP-1 po aplikaci endotoxinu v různých koncentracích po dobu 24 hodin. Časový harmonogram cvičení: 24. 11. 2008 Teoretický úvod: - laboratoř buněčných kultur, kultivace buněk, typy buněčných kultur, měření základních parametrů cytokinetiky, vyjadřování výsledků atd. - apoptóza a metody její detekce, diferenciace a její detekce Praktické cvičení: - seznámení s laboratoří buněčných kultur a jejím vybavením - kultivace a pasážování různých typů buněčných linií - detekce apoptotických buněk (stanovení apoptotického indexu - barvení pomocí DAPI a fluorescenční detekce buněk s kondenzovaným a fragmentovaným chromatinem; měření mitochondriálního membránového potenciálu apoptotických buněk pomocí barvení TMRE (tetrametyl rhodamin etylester) a detekce průtokovou cytometrií - stanovení stupně diferenciace epiteliálních buněk z nádorové linie kolonu (HT-29) po indukci butyrátem sodným (NaBt) - kolorimetrické stanovení aktivity alkalické fosfatázy. 1.12. 2008 Diferenciace leukemických buněk: - stanovení počtu a viability buněk myeloidní linie HL-60 - detekce povrchových molekul CD11b a CD14 u buněk HL-60 průtokovou cytometrií - stanovení míry oxidativního vzplanutí jako ukazatele diferenciace u buněk HL-60 za použití různých aktivátorů fagocytózy na destičkovém luminometru. ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) metoda: - stanovení cytokinu - tumor nekrotizujícího faktoru alfa (TNF) pomocí komerčního kitu v médiu získaného z diferencovaných myeloidních buněk po aplikaci endotoxinu v různých koncentracích po dobu 24 hodin. 8. 12. 2008 Fluorescenční a konfokální mikroskopie - Princip funkce fluorescenčního mikroskopu (výhody a limitace), rozdíly mezi konvenční a konfokální mikroskopií. Pozorování trojrozměrně fixovaných interfázních jader - vysokorozlišovací cytometrie - Izolace celkové RNA z připraveného buněčného lyzátu pomocí komerčního kitu, stanovení koncentrace a kvality na přístroji Nanodrop ND-1000 Spectrophotometer. - přehledné seznámení s dalšími metodami (detekce exprese specifických proteinů Western blotting, elektroforéza SDS-PAGE, imunodetekce)