CYTOKINETICKÉ PARAMETRY PROLIFERACE VIABILITA DIFERENCIACE (APOPTÓZA) PROLIFERACE — Množení buněk mitózou — Dostatek živin, růstových faktorů, pH a teplota prostředí (kultivační techniky) + ovlivnění? — Metody stanovení počtu buněk: ¡ nespecifické barvení všech proteinů/DNA (metylénová modř, neutrální červeň, tetrazoliové soli MTT, WST1/ CyQuant) ¡ Bürkerova komůrka ¡ Počítač částic (Coulter counter) Postup: 20 ml b. suspenze do 10 ml hemasolu … 500 x ředěno Counter nasaje 0,5 ml Př.: 1.10^3 b. …. 0,5 ml /x2 2.10^3 b. …. 1 ml /x500 1.10^6 b/ml Viabilita — Životnost buněk (vs. mortalita) — Živé buňky – semipermeabilní cytoplazmatická membr. — Mrtvé buňky – permeabilní cytoplazmatická membr. — DYE EXCLUSSION ASSAYS ÷ Živá buňka je schopna zabránit průniku barviva dovnitř Barviva: eosin, trypanová modř, propidium iodid, 7 amino actinomycin, acridin orange, Hoechst 33258 x 33342 EOSIN: SS 0,15% smíchat 1:1 s buněčnou suspenzí – kápnout do Bürkerovy komůrky … hodnotit 100 buněk – kolik z nich je mrtvých = oranžových PI: SS 1 mg/ml; WS 1 mg/ml … inkubace 1 minutu, hodnocení FACS živé buňky nenabarvené x mrtvé fluoreskují v FL2 Diferenciace — Rozrůznění buněk vlivem faktorů okolního prostředí — Změna biochemických procesů expresního profilu (mRNA, DNA, proteiny) morfologie povrchových antigenů — Detekce těchto změn biochemie molekulární biologie histologie/cytologie imunologie HL-60 = Akutní myeloidní leukémie (AML) n Zhoubná forma rakoviny kostní dřeně způsobená poruchou dozrávání hematopoietických prekurzorů (>20% blastických bb. v kostní dřeni) – 2,5% všech nádorů n HL-60 - Akutní myeloidní leukemie M3 – 5-8% AML n Genetické abnormality - často chromosomové translokace - t(15;17) – PML/RARa n Následek - nedostatek zralých krevních buněk - akumulace nezralých buněk (zvýšená proliferace a snížená apoptóza) v kr. dřeni, perif. krvi, slezině a játrech n Léčba – podpůrná léčba DIC (disseminated intravascular coagulation), podpůrná léčba pomocí G(M)-CSF - alogenní transplantace - diferenciační terapie ATRA – 25% pacientů RA syndrom + krátká remise - diferenciační terapie s trioxidem arseniku v post-remisi - Gemtuzumab ozogamicin – anti-CD33 MAb + calicheamicin Buňky HL-60 Diferenciační látky – princip účinku — (ATRA 1 mM) – PML/RAR protein méně účinný než RAR – ATRA zvyšuje jeho účinnost — Vitamín D3 (VD3, kalcitriol) – aktivace kinázových kaskád, translokace do jádra, aktivace VDR, ovlivnění transkripce — Phorbolmyristate acetate/12-O-tetradecanyl phorbol 13-acetate (PMA/TPA) – vazba na receptor asociovaný s protein kinázou C – PI3K – cAMP - pokles cMyc – zástava proliferace — Dimetyl sulfoxid 1,3 % (DMSO) – široké spektrum účinků – zvýšení fluidity membrány, aktivace kinázových kaskád, zvýšení Ca^2+, vazba na DNA - ovlivnění transkripce, demetylace Souběh drah ovlivňující kinázové kaskády, transkripční faktory (např. PU.1) a pak G/M/GM-CSF Metody detekce diferencovaných buněk Změna enzymového vybavení buněk — Nespecifické esterázy Hydrolýza a-naftyl acetátu esterázami vede k vzniku hnědého zbarvení — Detekce myeloperoxidázy Myeloperoxidáza štěpí peroxid kyslíku za vzniku kyslíkových radikálů, které pak oxidují o-dianisidin za vzniku barevných látek chinonového charakteru Produkce ROS při oxidativním vzplanutí (monocyty) — Redukce NBT (nitroblue tetrazolium) NBT je redukován superoxidem produkovaným monocyty. Redukce vede k změně barvy ze žluté na modrou — Oxidace/redukce luminolu ROS produkované monocyty oxidují luminol při redukci - chemiluminiscence Změna povrchových molekul — Exprese CD11b (R proC3b složku komplementu) a CD14 (vazba LPS) Změna morfologie Zvýšená adhese, pseudopodia, zástava proliferace Imunokomplex