Charakterizace proteinů hmotnostní spektrometrií Bi 7050 PŘÍPRAVA PROTEINOVÉHO VZORKU PRO MS ANALÝZU Hana Konečná Centrální laboratoř Oddělení funkční genomiky a proteomiky Přírodovědecká fakulta Masarykovy university PROTEOM komplexita 106 ? dynamika sekvence struktura abundance lokalizace modifikace interakce biochemická funkce geny - nositelé instrukce proteiny - vykonavatelé instrukce STRATEGIE SEPARACE fyzikální rozdíly chemické rozdíly lokalizace v buňce, solubilita, velikost, náboj, pI vysoké rozlišení jednoduché směsi proteinů vysoká kapacita automatizace centrifugace, postupná extrakce, chromatografie, elektroforéza počet AA typ AA sekvence PTM ALTERNATIVY SEPARACE 2D gelová elektroforéza IEF + SDS 1D gelová elektroforéza SDS PAGE BN PAGE... multidimenzionální LC MudPIT ICAT... proteinové čipy Functional protein arrays (protein proteinové interakce) Affinity arrays proteinový vzorek komplexní směs peptidů komplexní proteinový vzorek jednoduchý směs peptidů jednoduchá databáze identifikace kvantifikace 2D GE proteinové čipy multiD-LC MS MS/MS charakterizace modifikace dvourozměrná gelová elektroforéza 2D GE (multidimenzionální) kapalinová chromatografie DVOUROZMĚRNÁ GELOVÁ ELEKTROFORÉZA 2D GE vzorek solubilizace deplece/obohacení 2D GE prefrakcionace digesce in-gel směs peptidů odsolení MALDI-MS ESI-MS ESI-MS/MS separace RP-HPLC nebo CE PMF fragmentační spektrum PST identifikace proteinu ANALYZOVANÝ VZOREK SOLUBILIZACE VZORKU nekovalentní interakce ­ denaturace detergenty CHAPS, Triton, Nonidet chaotropy močovina, thiomočovina disulfidické můstky ­ redukce inhibice proteáz, fosfatáz, glykozidáz odstranění solí, lipidů, polysacharidů, NA ZÁKLADNÍ PRAVIDLA zabránit proteolýze jednoduchý postup čerstvé reagencie čerstvý vzorek odstranit pevné částice - centrifugace odstranit kontaminanty KONTAMINANTY soli, zbytky pufrů malé endogenní molekuly iontové detergenty nukleové kyseliny polysacharidy lipidy fenolické látky SOLUBILIZACE 2D GE první rozměr IEF druhý rozměr SDS-PAGE ISOELEKTRICKÝ BOD PRVNÍ ROZMĚR 2D GE ISOELEKTRICKÁ FOKUSACE IPG STRIPY překrývající se rozsahy široký rozsah 3-10, 3-10NL úzký rozsah mikro rozsah ROZSAH STRIPU MW rehydratace aplikace vzorku ochrana cysteinu fokusační podmínky FOKUSAČNÍ PARAMETRY Protean IEF Cell DRUHÝ ROZMĚR 2 DE GE 3 10 SDS-PAGE ELEKTROFORÉZA DETEKCE PROTEINU * gel x blot * visualizace barvení radioaktivita imunodetekce * barvení v gelu po elektroforéze před elektroforézou specifické pro protein specifické pro PTM viditelné spektrum fluorescence BARVENÍ PROTEINU V GELU Coomassie Blue R-250 Coomassie Blue G-250 Stříbro: kompatibilní s MS nekompatibilní s MS Sypro Ruby Flamingo Pink Pro-Q Diamond Pro-Q Emerald 0.6 ng (8 ng) 36 ng 1 - 4 ng Stříbro Coomassie Sypro Ruby CITLIVOST BARVENÍ PROTEINU BARVENÍ PROTEINU - LINEARITA ANALÝZA OBRAZU referenční mapa paralelní vzorky ˇ průměrný gel ˇ kvalita ˇ kvantita ˇ porovnání referenčních map pI Mr Sekretované vesikly kmenových buněk Lymfocyty pI PDQuest BIOMARKER * detekuje přítomnost onemocnění * přispívá k zvládnutí nemoci - předpověď a potvrzení účinku léku staré Řecko ­ sladká moč dnes asi 150 proteinů klinicky relevantních VALIDACE * analytická stabilní robustní metoda * biologická biochemické dráhy a jejich změny, biologická variabilita u zdravých * klinická prediktivní předpověd klinické změny, > než biologická variabilita personalizovaná medicína vlastní kontroly etické problémy kupka sena Biomarkery onemocnění GvHD v lidské plasmě Den 21 ­ před klinickým projevem GvHD Den 44 ­ po klinickém projevu GvHD 2D GE INSTRUMENTACE Protean IEF Protean Dodeca Cell Densitometer GS-800 PDQuest, Quantity One STORM Protean Plus Dodeca Cell Mini-Protean 3 Dodeca Cell Protean II xi Cell 2D or not 2D ? rozlišení vizuální aspekty multigelové jednotky dynamický rozsah extrémní proteiny (membránové,basické...) reprodukovatelnost, image analýza citlivost barvení pracnost nesnadná automatizace postdigesční extrakce Washington, DC Dr. Leigh Anderson, 2002 PREFRAKCIONACE Zoom IEFMicroRotofor PREFRAKCIONACE MIKRO ROZSAH pI pI odstranění abundantních proteinů HSA VivaPure PROT20 ... Vivapure Kit DEPLECE SDS PAGE Protean II Mini-Protean 3 Mini-Protean 3 Dodeca Cell bakteriofág 812 Difference Gel Electrophoresis DIGE separace identifikace depletovaná plasma Calcium-Depleted Human C-Reactive Protein Amyloid related serum protein BSA vesikly kmenových buněk DIGESCE * IN-GEL * IN-SOLUTION trypsin Glu-C Asp-N thermolysin MAVEPFPRRPITRPHASIEVDTSGTGGSAGSSEKVF CLIGQAEGGEPNTVYELRNYAQAKRLFRSGELLD AIELAWGSNPNYTAGRILAMRIEDAKPASAEIGGL KITSKIYGNVANNIQVGLEKNTLSDSLRLRVIFQD DRFNEVYDNIGNIFTIKYKGEEANATFSVEHDEET QKASRLVLKVGDQEVKSYDLTGGAYDYTNAIITD INQLPDFEAKLSPFGDKNLESSKLDKIENANIKDK AVYVKAVFGDLEKQTAYNGIVSFEQLNAEGEVPS NVEVEAGEESATVTATSPIKTIEPFELTKLKGGTN GEPPATWADKLDKFAHEGGYYIVPLSSKQSVHAE VASFVKERSDAGEPMRAIVGGGFNESKEQLFGRQ ASLSNPRVSLVANSGTFVMDDGRKNHVPAYMVA VALGGLASGLEIGESITFKPLRVSSLDQIYESIDLDE LNENGIISIEFVRNRTNTFFRIVDDVTTFNDKSDPV KAEMAVGEANDFLVSELKVQLEDQFIGTRTINTS ASIIKDFIQSYLGRKKRDNEIQDFPAEDVQVIVEGN EARISMTVYPIRSFKKISVSLVYKQQTLQA MS ALTERNATIVA 2D GE MULTIDIMENZIONÁLNÍ CHROMATOGRAFIE PROTEINY A PEPTIDY PRINCIPY SEPARACE KAPALINOVOU CHROMATOGRAFIÍ Isokratická eluce Gradientová eluce CO ROZHODUJE KOLONA náboj hydrofobicita biospecifická afinita velikost molekuly ionex reverzní fáze afinitní gelová TYPY LC SEPARACE IONEXOVÁ CHROMATOGRAFIE Isoelektrický bod Funkční skupiny u ionexových matricí RP CHROMATOGRAFIE reversed-phase chromatography Funkční skupiny u RP matricí AFINITNÍ CHROMATOGRAFIE IMAC Immobilized Metal Affinity Chromatography PHOS Select Iron Affinity gel Kasein Kasein tryptic digest Surový Po aplikaci Surový Po aplikaci GELOVÁ CHROMATOGRAFIE HPLC LC PERFÚZNÍ KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE POROS RP SAX WAX Application-Specific RP SCX WCX HIC Activated Affinity Affinity klasický sorbent POROS BioCAD 700E MC Poros Ni2+MC POROS Čistota 95 % Perfúzní MC chromatografie 1 hodina Agaróza MC chromatografie 2 hodiny Gelová chromatografie 10 hodin Metalochelatační purifikace his-tag proteinu Petra Borkovcová Kolona může vypadat různě . . . C18 C4 MC SCX Zip Tip Millipore Glygen TopTip NuTip MULTIDIMENZIONÁLNÍ CHROMATOGRAFIE kombinace odlišných fyzikálních a chemických separačních principů diskontinuální kontinuální dvoufázová kolona ProteomeLab PF 2D chromatofokusace RP MULTIDIMENZIONÁLNÍ CHROMATOGRAFIE PRO velké objemy vzorku možnost koncentrace na koloně membránové proteiny, basické proteiny není nutno barvit peptidy ­ přímé napojení na MS automatizace vizuální aspekty ztraceny: pI a Mr LC je sériová analýza GE může běžet současně pro více vzorků PROTI KOMPLEMENTARITA METOD M. Hecker, University of Greisfwald, bakteriální proteom, HUPO 2005 2D GE 2D-LC 168 467 607 13% 49% 38% LITERATURA R.M. Twyman: Principles of Proteomics R.Westermeier, T.Naven: Proteomics in Practice A.J.Link: 2D Proteome Analysis Protocols T.Rabilloud: Proteome Research: Two-dimensional Gel Electrophoresis and Identification Methods Busy Researcher´s Guide to Biomolecule Chromatography Current Protocols in Protein Science G I G O GARBAGE IN - GARBAGE OUT G I G O