Charakterizace proteinů hmotnostní spektrometrií
                                              Bi 7050

                         PŘÍPRAVA  PROTEINOVÉHO  VZORKU  PRO  MS  ANALÝZU





                                           Hana Konečná



                                        Centrální laboratoř



















                                       SOLUBILIZACE   VZORKU

§    nekovalentní interakce – denaturace    detergenty

                                                                                        CHAPS,
Triton, Nonidet

                                                         chaotropy

                                                                                         močovina,
thiomočovina

§    disulfidické můstky – redukce



§    inhibice proteáz, fosfatáz, glykozidáz



§    odstranění solí, lipidů, polysacharidů, NA

                                         ZÁKLADNÍ PRAVIDLA

§    zabránit proteolýze

§    jednoduchý postup

§    čerstvé reagencie

§    čerstvý vzorek

§    odstranit pevné částice - centrifugace

§    odstranit kontaminanty

                                           KONTAMINANTY

§    soli, zbytky pufrů

§    malé endogenní molekuly

§    iontové detergenty

§    nukleové kyseliny

§    polysacharidy

§    lipidy

§    fenolické látky









2D GE



                                       PRVNÍ  ROZMĚR  2D GE







§      rehydratace

§      aplikace vzorku

§      ochrana cysteinu

§      fokusační podmínky









BARVENÍ PROTEINU - LINEARITA









Biomarkery onemocnění GvHD v lidské plasmě



2D or not 2D ?

n  rozlišení

n  vizuální aspekty

n  multigelové jednotky

n  dynamický rozsah

n  extrémní proteiny (membránové,basické...)

n  reprodukovatelnost, image analýza

n  citlivost barvení

n  pracnost

n  nesnadná automatizace

n  postdigesční extrakce











PREFRAKCIONACE

PREFRAKCIONACE
MIKRO ROZSAH

SDS PAGE





separace                                   identifikace



ALTERNATIVA  2D GE
MULTIDIMENZIONÁLNÍ  CHROMATOGRAFIE

PROTEINY A  PEPTIDY
PRINCIPY  SEPARACE  KAPALINOVOU  CHROMATOGRAFIÍ

















IMAC
Immobilized Metal Affinity Chromatography
PHOS Select Iron Affinity gel



HPLC
LC
PERFÚZNÍ











MULTIDIMENZIONÁLNÍ  CHROMATOGRAFIE




MULTIDIMENZIONÁLNÍ  CHROMATOGRAFIE
            PRO

KOMPLEMENTARITA  METOD

LITERATURA