Apoptóza nádorových buněk tlustého střeva po působení TRAILu a metody její detekce
Přednáška 6.12.2005 RNDr. Alena Vaculová, Ph.D.
ylohinetikv
nioFvMhälni ůilnv flVCflr BnHO
Výzkum zabývající se problematikou apoptózy je stále aktuální a rozvíjející se oblastí vědy.
Má možnosti široké aplikace jak v základním výzkumu, tak v klinické praxi.
Regulace průběhu buněčné smrti patří mezi klíčové funkce nutné pro udržení normálních funkcí organismu.
V případě jejího porušení může docházet
k nekontrolovatelnému úbytku buněk nebo naopak
k jejich akumulaci v organismu (např. při nádorovém
onemocnění).
Důkladné pochopení mechanismů apoptózy je proto nutným předpokladem pro úspěšnou terapii řady onemocnění.
■ selektivní indukce apoptózy u celé řady nádorových buněk, ne však u většiny normálních
_ (na rozdíl od TNF, Fas)
TRAIL-R1 (DR-4, APO-2) TRAIL-R2 (DR-5, TRICK, Killer) TRAIL-R3 (DcR1) TRAIL-R4 (DcR2, TRUNDD) TRAIL-R5 (osteoprotegerin)
TRAIL „death receptor"
Prokaspáza-8 b
FADD
Kaspáza-8
Efektorové kaspázy
Buněčná membrána
Mcl-1 Bcl-2 Bax
tBid Bak
□
Mitochondrie
O
Cytochrom c
dATP
^[] Apaf-1
r£b
Kaspáza-9
o O 1=1 □I U
Prokaspáza-9
Kas páza-6    Kas páza-3
i i
jádro
„Death" substráty
Ovlivnění citlivosti buněk k účinkům TRAILu
- na úrovni receptoru
- množství DRs a DcRs, jejich mutace
- na úrovni jednotlivých proteinů v signální dráze TRAILu
- kaspáza-8, FLIP
- Smac/DIABLO
- inhibitory apoptózy (lAPs)
- NF-kappaB
- Bcl-2 rodina (Mcl-1, Bcl-2, Bax...)
- kinázy
- atd.....
L
r
Popis signálních drah TRAILu je velmi důležitý pro pochopení mechanismu jeho působení, mechanismů rezistence a pro správné zacílení
rot i nádorové terapie
Důležitost srovnání citlivosti normálních a nádorových buněk - rozdíly v signálních drahách? Na kterých úrovních signální dráhy se projevuje rezistence?
Přinese toto srovnání více informací o tom, proč TRAIL selektivně indukuje apoptózu u nádorových buněk a proč je většina nádorových buněk k jeho působení rezistentní?
I
TRAIL „death receptor"
Prokaspáza-8 b
Buněčná membrána
FADD
Mcl-1 Bcl-2 Bax
tBid Bak
□
Mitochondrie
Cytochrom c |^[] Apaf-1
Prokaspáza-9
jádro
- cysteinové proteázy, specificky štěpí proteinové substráty v místě kyseliny asparagové
- klíčová úloha v přenosu apoptotického signálu
- v inaktivní formě (proenzymy, pro-kaspázy), štěpení -aktivní kaspáza schopná dále štěpit tzv. „death substráty"
- struktura:
- Prodoména
- Katalytické podjednotky - velká a malá (heterotetramer)
-dělení:
- Iniciační kaspázy (dlouhá prodoména) - kaspázy-8, -9
- Efektorové (krátká prodoména) - kaspáza-3
L
Inactive Proenzyme C Prodomain ^ Large
AepX
subunits
Small
Asp X
Catal yticSitGS
U
Active Caspase
-Substráty kaspáz:
PARP - poly(ADP)ribosyl polymeráza
cytokeratiny (CK18) actin, fodrin, lamin kaspázy - proteiny Bcl-2 rodiny - Bid -kinázy (PKC) -atd.
L
KasDáza-8
■
- iniciační kaspáza aktivovaná na úrovni signálního komplexu DISC
-v DISCu se pro kaspáza-8 (55/57) štěpí na kaspázu-8, vznikají fragmenty o velikosti 41/43 a 10/18 kDa (dvoukrokový mechanismus aktivace)
- FLIP - inhibitor kaspázy-8, brání její aktivaci, neboť se sám váže do DISCu
- aktivní kaspáza může dále aktivovat dvě základní dráhy (přímá aktivace kaspázy-3, dráha závislá na mitochondriích - protein Bid)
I
■ initiator caspase
■ pro-caspase-8 (55/57 kDa) is activated in the DISC in an autoproteolytic manner by two subsequent cleavage steps
TRAIL
?????????????
QQQ
cFLIP
tBid
/
Bel -2 rodina (Bax, Bcl-2)
\
FADD
TRAIL-R
/
DISC
Caspase-8
Bid
Caspase-3
Cytochrom c
Caspase-9
Smac/DIABLO-like proteins.....
Death substrates (PARP...)
Kas oáza-8 - aktivita a štěpení
KasDáza-9
- iniciační kaspáza v mitochondriální dráze indukce apoptózy
- aktivovaná na úrovni apoptozomu - signální komplex: cytochrom c, Apaf-1, pro kaspáza-9
- aktivace prokaspázy-9 - štěpení
- aktivovaná kaspáza-9 dále štěpí (aktivuje) mj. kaspázu-3
alaborafory ytekinetics
Kas oáza-9 - aktivita a štěpení
kasDáza-3
cp-3 se nachází v inaktivním stavu ve formě tzv. pro-kaspázy-3 (CPP32, Yama, apopain) o Mr = 32 kDa
při aktivaci je štěpena na dva fragmenty o Mr přibližně 20 a 12 kDa
Efektorová kaspáza, po aktivaci je zodpovědná za štěpení celé řady substrátů (PARP, CK18....)
Kas oáza-3 - aktivita a štěpení
400
350
co
> ^ 300 o. ô 250
(0 i
JE § 200
ä í 150
> Ľ.
2 100 ro 50
kontrola TRAIL
32
r
PolvíADP-ribosvl) Dolvmerase ÍPARP
Jaderný protein (113 kDa), opravy DNA
Během apoptózy specificky štěpený na fragmenty 89 a 24 kDa
citlivý marker pro detekci apoptózy
Inaktivace PARP blokuje opravu DNA, posílení fragmentace DNA
í kaberatery
ytekinetic
DNA strand nicks
massive DNA disruption
repair
PARP activation
NAD+ Poly(ADP-ribosyl)ation
PARP OVERACTIVATION
NAD+ Poly(ADP-^ ribosyl)ation
4 ATP
Energy metabolism
Energy failure
CELL DEATH
TRAIL
„death
receptor"
Prokaspáza-8 b
FADD
Kaspáza-8
Efektorové kaspázy
Buněčná membrána
Mcl-1
Bcl-2
Bax
tBid Bak
□
Mitochondrie
CYTOSKELET
o
Cytochrom c
dATP
^[] Apaf-1
Kaspáza-9
o O 1=1 □I U
Prokaspáza-9
Kaspáza-6 Kaspáza-3
1 1
jádro
„Death" substráty
štěpení cytokeratinů 18
-již během raných fází apoptózy dochází ke štěpení důležitých složkek cytoskeletu - cytokeratinů
- detekce štěpení cytokeratinů 18 - velmi citlivá metoda detekce apoptózy, obzvláště určená pro epitheliální buňky!
- štěpení CK18 efektorovými kaspázami - odkrytí specifického epitopu v nolekule CK18 - marker apoptózy - ten detekován pomocí specifické protilátky, která je fluorescenčně značená
Monoklonální Ab proti specifickému epitopu CK 18, konjugovaná s FITC
_
TRAIL „death receptor"
Prokaspáza-8 b
FADD
Kaspáza-8
Efektorové kaspázy
Mcl-1 Bcl-2 Bax
tBid Bak
□
Mitochondrie
O
Cytochrom c
dATP
^[] Apaf-1
Kaspáza-9
o O 1=1 □I U
Prokaspáza-9
Kas páza-6    Kas páza-3
i i
jádro
„Death" substráty
PLAZMATICKÁ MEMBRÁNA		
	Annexin V assa1	1
- Detekce translokace (externalizace) fosfatidylserinu v plazmatické membráně (odlišná distribuce u „normální" a apoptotické buňky)
- Detekce raných fází apoptózy
- dvojí barvení annexin V - FITC, propidium jodid (živé buňky)
Art ns* in W-PE tůiijuyalů
Plasma itiembťariů
O O
o
A pop t os is
-►
ErtarriaHzatlon of pMůspliatldyFBefintí
Cytůplaarti
Ca"-
WO
Cytoplasm
Ca"
o
Schematic representation    the Aíimůkiii assay.
r
-PI - rozlišení živých a mrtvých buněk (integrita plazmatické membrány)
- annexin-V - pozitivní buňky - buňky s translokovaným fosfatidylserinem (apoptotické + nekrotické)
- apoptotické buňky - PI-, annexin-V +
TRAIL „death receptor"
„ , , n _ FADD Prokaspaza-8 □
Kaspáza-8
Efektorové kaspázy
Buněčná membrána
Cytochrom c ^[] Apaf-1
Prokaspáza-9
Kas páza-6    Kas páza-3
i i
jádro
„Death" substráty
r
L
MITOCHONDRIE
centra buněčného dýchání, energetická centra buňky složení:
vnější membrána - semipermeabilní (5 kDa), kanálky (porin)
vnitřní membrána - nepropustná, pouze selektivní transport, bohatě členěná (kristy - zvětšení povrchu - syntéza ATP), zde ukotveny proteiny - součásti elekron-transportního řetězce, transport elektronů a syntéza ATP
intermembránový prostor (enzymy, proapoptotické proteiny)
matrix - vysoce koncentrovaná směs enzymů, DNA, ribozomy, citrátový cyklus
»uter mitochondrial hnembrane
Inner mitochondrial membrane
I n te rmemb rane
Matrix
High [H+]= low pH [H+]= high pH
© 2003 Thomson - Wadsworth
Electron transport leads to proton pumping across the inner mitochondrial
		MMP normální buňka vs. apoptotická
		
Úloha mitochondrií v apoptóze
Změny v transportu elektronu
Změny energetického metabolismu buňky
Změny v produkci ROS
Změny mitochondriálního membránového potenciálu
- Účast proteinů rodiny Bel-2 (Bid, Bak, Bax...) -Uvolnění proapoptotických proteinů
Ado2.7
- 38 kDa protein na membráně mitochondrií
-exprimován u apoptotických buněk, v raných fázích apoptózy
Měření mitochondriálního membránového potenciálu
Ztráta MMP se hodnotí jako nepřímý důkaz otevření megapórů a zvýšení permeability vnější mitochondriální membrány, které hraje úlohu při vylití některých mediátorů apoptózy z těchto organel.
Při analýze MMP se používá fluorescenční lipofilní katión TMRE (tetramethylrhodamin ethyl ester), který se hromadí v mitochondriích v závislosti na MMP.
S využitím průtokové cytometrie lze detekovat posun ve fluorescenci TMRE, podávající informaci o změnách MMP.
L
r
Měření mitochondriálního membránového potenciálu
Flowcytometr - po obarvení TMRE
Hodnocení % buněk se sníženým MMP
L
MMP ÍTMRE
I
Cellular Respiration
HoO + O.
Oxidative Burst
Protein Peroxidation
Environmental Factors
Lipid Peroxidation
DNA Damage
by GP. Eckert
www. b JQzentru m. u n i-fra n kfu rt.d e/Pha rma kolog ie/i ndex .html
- 2nd messengers vs. oxidativni poškození - rozlišovat!!!!
ROS vs. TRAIL
Měření produkce reaktivních kyslíkových
metabolitů (ROS) - průtokový cvtometr
Peroxid vodíku
dihvdrorhodamin-123 (DHR-123)
dichlorofluorescein diacetát (DCFH-DA)
-Superoxid
- hydroethidin (HE)
+ naše experimenty
medián fluorescence
Ca) O CO  N)  Ol 00
1
Proteiny rodiny Be 1-2
Bcl-2-like survival factors
BH4 BH3 BH1
-CZh
iZZI-CZh
Bax-like death factors
BH2
membrane anchor
iZZh
HZZI-□-CZh-CZr-
Bcl-2
Bcl-x,
Mcl-1
BH3 BH1
HZZI-IZZh
BH2
H Bax -CZh-CZH Bak
BH3-only death factors
BH3
Bik
Bad
Bid
Noxa PUMA
Bmf
Bcl-XL Mcl-1
Death blocker
Bcl-2
Cell death signal
t
CHECKPOINT
Death inducer
(Bax)
Bak Bad Bid
Death signal blocked
1
CELL SURVIVAL
Death signal promoted
I
CELL DEATH
Mcl-1
-Antiapoptotický protein z Be I-2 rodiny
-Transientní indukce exprese po působení některých růstových faktorů a cytokinů
-Úloha v regulaci diferenciace a apoptózy
-Krátký poločas rozpadu, short-term viability protection (odlišná kinetika, předchází Bcl-2), po vstupu do apoptózy jeho hladina v buňce prudce klesá, což může ovlivnit spuštění mitochondriální dráhy indukce apoptózy -translokaci Bax, uvolnění cytochromu c, Smac/DIABLO, aktivaci kaspáz...
Bid
■ proapoptotic Bcl-2 family member
■ regulates cytochrome c release from mitochondria by inducing the homo-oligomerization of proapoptotic members of the Bcl-2 family (Bax)
laboratory lytokinetics
r
Proteiny Bcl-2 rodiny v signální dráze TRAILu:
[Vaculová A., Hofmanová J., Souček K., Anděra L., Kozubík A.: Ethanol functions as a potent agent sensitizing the colon cancer cells to the TRAIL-induced apoptosis, FEBS Letters, 577, 309-313, 2004)
TRAIL - 100 nq/ml - HT-29 - 4h
Bid - významné štěpení - tBid Bax - množství proteinu se nemění Bak - množství proteinu se nemění Bcl-2 - není přítomen
Mcl-1 - významný nárůst množství proteinu
úloha proteinu Mcl-1 v rezistenci buněk HT-29 k účinkům TRAILu??
TRAIL
„death
receptor"
Prokaspáza-8 b
FADD
Kaspáza-8
Efektorové kaspázy
Buněčná membrána
Mcl-1
Bcl-2
Bax
tBid Bak
□
Mitochondrie
O
Cytochrom c
dATP
^[] Apaf-1
Kaspáza-9
o O 1=1 □I U
Prokaspáza-9
Kaspáza-6 Kaspáza-3
1 1
„Death" substráty
JÁDRO
Charakteristické změny jádra během apoptózy
- kondenzace a fragmentace jaderného chromatinu (typická morfologie jádra apoptotických buněk)
- internukleozomální štěpení DNA (fragmenty o velikosti 180 bp)-tzv. „žebříček" DNA (agarózová gelová elktroforéza)
Hodnocení jaderné morfologie buněk
■
Barvení DNA - DAPI, pak hodnocení - fluorescenční mikroskop - charakteristická apoptotická morfologie jádra - kondenzace a fragmentace jaderného chromatinu)
			..t ^fl i	
				
■ A. J				
-           .■ ,           L      - 1				
Hodnocení jaderné morfologie (fluorescenční mikroskop)
Detekce fragmentace DNA - TUNEL
Pro detekci fragmentace DNA se hojně využívá metody TUNEL (terminal deoxynucleotidyl dUTP nick labeling).
Vzniklé zlomy DNA lze identifikovat pomocí enzymatického značení jejich 3'OH konců nukleotidy konjugovanými s FITC.
Velmi výhodné je současné obarvení DNA propidium jodidem, což umožní jak určení celkového obsahu DNA, tak detekci zlomů.
Takto lze detekovat, zda indukce fragmentace DNA je specifická pro určité fáze buněčného cyklu.
I
- apoptóza nádorových buněk tlustého střeva po
působení TRAILu
- plazmatická membrána - změny uspořádání fosfolipidů -fosfatidyl serin
- cytoskelet - štěpení cytokeratinů - cytokeratin 18
- cytoplazma - kaspázy, substráty kaspáz
- mitochondrie - membránový potenciál, produkce ROS, proteiny Bcl-2 rodiny, apoptotické proteiny uvolňované z mitochondrií, Apo2.7 protein
-jádro - jaderná morfologie, internukleozomální štěpení DNA, PARP