BUNEČNÉ SPOJE A ADHEZE Většina buněk v mnohobuněčném organismu je organizována do kooperativních spojení - tkání a ty jsou sloučeny v různých kombinacích do větších funkčních jednotek -orgánů. Buňky v tkáních jsou obvykle v kontaktu s komplexní sítí sekretovaných mimobuněčných makromolekul - mimobuněčnou matrix (ECM). Ta pomáhá držet buňky v tkáních pohromadě a vytváří prostor, kde mohou buňky migrovat a interagovat. V mnoha případech jsou buňky v tkáních udržovány na místě přímými buněčnými adhezemi. U obratlovců jsou hlavními typy tkání nervová, svalová, krevní, lymfatická, epiteliální a spojovací. V spojovacích tkáních je mnoho ECM a buňky jsou v ní volně rozptýleny. Matrix je bohatá na vláknité polymery, zejména kolagen a je to matrix (spíše než buňky) která nese většinu mechanického stresu. Buňky jsou napojeny na komponenty matrix a jejich vzájemné spojení není příliš důležité. Naopak v epiteliálních tkáních jsou buňky spojeny těsně mezi sebou do vrstev (epitelu) a EM tvoří hlavně tenkou basální laminu, na které leží epiteliální vrstva. Zde jsou to zejména buňky, které nesou většinu mechanického stresu prostřednictvím silných vnitrobuněčných proteinových vláken (složek cytoskeletonu), které křižují cytoplasmu každou epiteliální buňku. Pro přenos mechanického stresu z jedné buňky na druhou jsou vlákna přímo nebo nepřímo na pojena na transmembránové proteiny v plasmatické membráně, kde se tvoří specializované spoje mezi povrchy sousedních buněk a se spodní bazálni laminou. Epiteliální vrstvy vyplňují dutiny a volné povrchy v těle a specializované spoje mezi buňkami umožňují těmto vrstvám tvořit bariéry pro pohyb vody, roztoků a buněk mezi jednotlivými tělními kompartmenty. Villus Cell shedding Differentiation and migration 24-48 hr Differentiated cells Crypt-villus junction :* Í Goblet Entero- Absorptive cells endocrine epithelial cells cells 33 t t Crypt Mitotic renewal # 24 36hr 'i Lamina propria Proliferative progenitors Stem cell ■ '.*•-; Panem cell Fig. 1. The anatomy of the small intestinal epithelium. The epithelium is shaped into crypts and villi (left). The lineage scheme (right) depicts the stem cell the transit-amplifying cells, and the two differentiated branches. The right branch constitutes the enterocyte Lineage; the left is the secretory lineage. Relative positions along the crypt-villus axis correspond to the schematic graph of the crypt in the center. Obnova střevní výstelky LUMEN OF GUT |epithelial eel! migration from "birth" at the bottom |of the crypt to loss at the top of the villus Ktransft time is ■3—5 days) lepithelia bells Icrypt lloose Iconnective tissue villus (no cell divisioi cross sectH of villus cross section of crypt villus absorptive brush-border cells mucus-secreting goblet cells direction of movement (A) nondividing differentiated Paneth cells nondividing differentiated- cells rapidly dividing cells (cycle time - 2 hours slowly dividing ste cells (cycle time > 24 hours crypt 100 urn JFigure 22-19 part 1 of 2. Molecular Biology of the Cell, 4th Editi r Příčný řez částí stěny střeva LUMEN OF GUT Ismooth muscle epithelium —E connective tissue circular fibers longitudinal fibers " connective tissue epftheliu m epithelial cell fibroblast smoothl muscfe cells epithelial cell Figure 19^1. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition. Každá tkáň je organizovaným seskupením buněk držených pohromadě buněčnými adhezemi, ECM nebo oběma.Tkáně jsou spojeny dohromady v různých kombinacích a tvoří funkční jednotky - orgány J ADHEZNÍ INTERAKCE - interakce zprostředkované membránovými molekulami. Na základě strukturních vlastností rozlišujeme rodinu: ► kadherinů (asi 80 typů) ► imunoglobulinů (přes 700 typů) ► integrinů ► selektinů Slouží nejen ke spojení buněk navzájem a k jejich zakotvení v daném kompartmentu, ale jsou spojeny s aktivací buněk, s přenosem signálu do nitra buněk a s komplexní buněčnou odpovědí (regulace buněčného cyklu, indukce diferenciace, apoptózy, atd.). Adhezní interakce jsou klíčové pro zajištění aktivity imunitního systému. r Typy vazeb 1) homofilní (homotypická) vazba - váží se stejné molekuly sousedních b. 2) heterofilní (heterotypická) vazba - váží se různé molekuly 3) receptory na povrchu buněk jsou spojeny navzájem sekretovanou spojovací molekulou. Mechanizmy, jimiž mohou povrchové molekuly zprostředkovat buněčné adheze BINDING THROUGH HOMOPHILIC BINDING HETEROPHILS BINDING AN EXTRACELLULAR LINKER MOLECULE iyjre 19-26. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition. r BUNEČNÉ SPOJE, ADHEZE a MIMOBUNECNA MATRIX (ECM) Buněčné spoje (junctions) - tň funkční skupiny: ► „tight junctions" (TJ) - těsné spoje (epitel střeva) selektivně propustná bariéra - udržují lokální koncentraci tekutin ► "anchoring junctions" - ukotvující spoje - mechanicky spojují buňky a jejich cytoslekelet se sousedními buňkami nebo ECM - časté u tkání vystavených mechanickému stresu (pokožka) místa připojení filament aktinu: spoje buňka-buňka (např. adhezívní pásy u epitelů) spoje buňka-matrix (fokální kontakty nebo adhezivní plaky ) místa připojení intermediárních filament: spoje buňka-buňka (desmosomy) spoje buňka-matrix (hemidesmosomy) ► "communicating junctions"- komunikační spoje -nebo el. signálů mezi interagujícími buňkami, "gap junctions" - mezerovitá spojení chemické synapse zprostředkovávají přenos chem. Těsná spojení slouží v epitelech jako bariéra difúze rozpuštěných látek TJ jsou vysoce dynamické struktury regulující přechod iontů a molekul v epiteliálních a endoteliálních buňkách. Tvořeny specifickými proteiny - okludiny, klaudiny Úloha těsných spojení v buněčném transportu Na "driven glucose symport apical surfac LUMEN I (glucose) OF GUT tight junction plasms membranes of adjacent cells interceliula space passive glucose carrier protein baso lateral ^eeil surface \^ -j jl extracellular fluid BLOOD LOW HIGH glucose concentration! LOW Figure 19-2. Molecular Biology of the Ceil, 4-th Edition. Aktivace signálních drah regulujících tvorbu a funkci těsných spojení Stimulus i MAPKKK 1 MAPKK 1 MAPK GKiddtTvp stress, alcohol. Bil*. CF. TGFjlJ. EGF+TGF01. FLGF^VEGF, TNFct, IFN-Tl HN-Tal, ritonavir, MMP7/&, EHEC and EPEC x TGFp, EGFk HGFi IL-t 7. fiuii>r,t:iii:i thiol, gkicocor lcoicfsn ostnroids and bain L0123 Rás 1 Raf I MEK 1/2 i Erh 1/2 Alcohol. Bils. CdCI2h TGFp3t TNFaJFN-T and 3Q-C(12}-H5L \ / MLKs I M K K 3/6 1 p 38 S62ŮI219Ů Thiol and enrloMatan AlCOhOl Thiol \ / MLKs 1 MKK 4/7 I JNK SP6GG1ÍS Phosphorylation of proteins in cytoplasm and nucleus j and I expresion of TJ proteins Decreased barrier function (e.g. t CI-2) Increased barrier function (e.g. | CI-2, tOcci, CI-1, 4 and 7 ) Fig. 5. Activation oflhe MAPK pathway can tead to TJ i^Lninfei or asstmbty depending on the agent that activates the cascade. The uppermost port too of:hc figure indicates the activators of the MAPK pathway thai lead to TJ disassembly {red) or that favor TJ tightening {hlucK The hierarchicalrv organisation of MAP signaling cascades into thrce-ticrcd modules of MAPKKK, MAPKK and MAPK is shown. Please cite this article as: L. Gonzalez-Mariscal, e: al., Crosstalk of tight junction components with signaling pathways, Biochim. Biophys. Acta (2007), doi: 10.10 lo7j.bhamcm.200 7.08.018 Ukotvující (anchoring) vazby (spoje) VAZBA TRANSMEMBRÁNOVÝ EXTRACELULÁRNÍ ADHEZNÍ PROTEIN LIGAND INTRACELULÁRNÍ CYTOSKELETÁRNÍ UPEVNĚNÍ INTRACELULÁRNÍ KOTEVNÍ PROTEINY [Buňka-Buňka Adherentní vazba Desmozóm m^-Matrix) Fokálníadheze Hemidesmozóm kadherin (E-kadherin) kadherin (desmoglein, desmocollin) kadherin v sousední buňce desmogleinya desmocolliny v sousední buňce aktinová vlákna intermediální vlákna integrin integrina6p4, BP180 proteiny extracelulární matrix proteiny extracelulární matrix aktinová vlákna intermediální vlákna a-ap-kateniny, vinculin, a-aktinin, plakoglobin (y-katenin) desmoplakiny, plakoglobin (y-katenin) talin, vinculin, a-aktinin, filamin plektin, BP230 Cell Adhesion Molecules (CAM) Buňky uvolněné z různých tkání embrya obratlovců (jsou-li smíchány dohromady) znovu přednostně spojují s buňkami téže tkáně. Tento tkáňově specifický rozeznávací proces u obratlovců je zprostředkován zejména rodinou na vápníkových iontech závislých adhezivních proteinů - kadherinů, které drží buňky pohromadě homofilními interakcemi mezi transmembránovými kadheriny přiléhajících buněk. Aby buňky držely pohromadě, musí být kadheriny připojeny k cytoskeletonu. Většina živočišných buněk má také na vápníku nezávislý adhezívní systém buňka-buňka, který zahrnuje zejména členy imunoglobulinové nadrodiny, jako jsou neurální adhezívní molekuly (N-CAM, ICAM apod.) Jednotlivé buněčné typy používají mnohonásobné molekulární mechanismy pro adhezi k jiným buněčným typům nebo EM, avšak specifita vzájemné buněčné adheze pozorovaná v embryonálním vývoji musí vyústit v integraci řady různých adhezivních systémů, z nichž některé jsou spojeny se specializovanými buněčnými spojeními a jiné r Adherentní spoje buňka-buňka ► závislé na Ca2+ 1 U epitelu často tvoří souvislý adhezivní pás (zonula adherens) kolem každé interagující buňky, lokalizovaný hned pod těsnými spojením. Homotypické mezibuněčné interakce jsou zprostředkovány transmembránovymi vazebnými glykoproteim - kadheriny (E-k. - epitelia, N-k. - nervové buňky, P-k. - placenta a epidermis). Na cytoplazm. straně membrány se tvoří komplexy C AC (Cadherine Associated Complex) spojující přes vazebné proteiny (a, ß, y- katenin, vinkulin, a-aktinin) kadherinové molekuly se svazky vláken aktinu. Desmosomy fungují jako nýty epitelia a spojovacích tkání. Uvnitř buněk fungují jako ukotvení pro intermediální fílamenta - keratinová filamenta (epitely), desminová filamenta (srdeční sval) Selektiny (P-, E-, L-) - menší rodina transmembránových glykoproteinů vážících se na cukerné zbytky na bílkovinách - přechodné vazby buněk v krevním řečišti - umožňují např. bílým krvinkám vazbu k endoteliálním b. a tak migrovat z krve do tkání v místech zánětu. ► nezávislé na Ca2+ zprostředkované členy imunoglobulinové superrodiny - zejména na leukocytech, ale i na endotelových, epiteliálních a dalších buňkách. ICAM (InterCellular Cell Adhesion Molecules) Heterotypické mezibuněčné vazby - aktivované u endoteliálních buněk, kde se váží s integriny bílých krvinek Schéma ukotvujícího spoje ze dvou tříd proteinů cytoskeletal plasma membranes filaments extracellular matrix intracellular anchor proteins transmembrane adhesion proteins Figure 19-8. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition. Napojení klasických kadherinů k aktinovým filamentům Cadherin dimer p120-catenins La plasma membrane CYTOSOL actin filament Figure 19-29. Molecular Biology of the CellF 4th Edition. Interakce kadherin-katenin Plasma membrane 63/ Catenins Actin cytoskeleton E-cadherin Wnt signální dráha a Wnt recepíor GSK-3 P d E-cadherin TCF-LEF Dimerizace molekul E-cadherinu je zävislä na Ca2+ B Cell membrane Calcium concentration <50 nM 50 - 500 nM 500 -1000 0 > 1000 itM r-H-H- Poruchy adheze zprostředkované E-kadherinem mohou vést k uvolnění buněk z tkáně Význam pro vznik nádorových metastáz Disruption of E-cadherin-mediated cell-cell adhesion Struktura a funkce selektinů význam pro funkci buněk imunitního systému [A) lectin domain EGF-líke domain EXTRACELLULAR SPACE anchor proteins actin filament basal lamina WEAK ADHESION STRONG ADHESION AND ROLLING AND EMIGRATION selectin-dependent) (integrln-dependent) white blood -cell endothelial — call CP Cfl co > c o -O tissue igure 19-30. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition. r Adherentní spoje buňka - mimobuněčná matrix Specializované oblasti membrány - fokální kontakty nebo adhezívní plaky, kde končí svazky aktinových vláken. ► Integriny - transmembránové vazebné proteiny - členové velké rodiny povrchových buněčných receptoru pro matrix zprostředkovávají adhezi a slouží jako spoj mezi matrix a svazky aktinu v plácích. Tvoří heterodimery (řetězce alfa a beta) ► Hemidesmosomy - podobné morfologicky desmosomům, ale funkčně a chemicky odlišné - spojují bazálni povrch epiteliálních buněk s bazálni laminou. j r INTEGRINY Základní receptory pro vazbu k ECM se slabou afinitou k ligandu Alfa a beta podjednotky jsou spojeny nekovalentními vazbami Fungují také jako přenašeče signálů - po aktivaci vazbou na matrix aktivují různé vnitrobuněčné signální dráhy, mohou kooperovat s jinými receptory a regulovat buněčnou proliferaci, přežívání i diferenciaci. S cytoskeletem, kinázami a s receptory pro růstové faktory jsou integriny propojeny adaptérovými proteiny. Nahloučené integriny tvoří tzv. imunologické rafty. Vznikají multimolekulové agregáty - místa fokální adheze Bez zakotvení přes integriny buňky nemohou přežívat. Integriny aktivují tyrosin kinázy, např. fokální adhezívní kináza (FAK -Focal Adhesion Kinase) a kinázy rodiny Src. FAK je spojena s proteiny talinem a paxilinem. Fosforylací dochází k aktivaci systému. Po ztrátě kontaktu s ECM dochází k tzv. anoikis (detachment induced apoptosis) - apoptóze indukované uvolněním buněk s fyziologických vazeb. j Indukce buněčné smrti-anoikis a změny adhezívních vlastností epiteliálních buněk kolonu • ANOIKIS představuje typ buněčné smrti, kterou umírají epiteliální buňky pokud dojde k narušení jejich kontaktu s extracelulární matrix. •Vznik rezistence buněk k anoikis představuje jeden z kritických momentů v karcinogenezi tlustého střeva -podpora invazivity Pro indukci anoikis v podmínkách in vitro je používán model neadherentní kultivace buněk DFF ca £ p a se -10 CNA-f^.jm-'itôíior — odl death ANOIKIS Struktura subjednotek integrinového receptoru (buněčný povrch-matrix) matrix Dinding i-1 HOOG ß subunit cy steine-rich domains talin, filamin, and c actinin binding plasma membrane cytosol 10 nm iFígure 19-64. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition. adheze (A) extracellular matrix protein integrin subunits plasma membrane EXTRACELLULAR SPACE (B) CYTOPLASM oe-actinin, talin, or filamin actin filament vinculin |Figure 19-12. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition Regulace mimobuněčné vazebné aktivity integrinu zevnitř buňky extracellular matrix protein extracellular signal l CELL ACTIVATION inactive signal integrin receptor INTEGRIN ACTIVATION "V /.intracellular signaling events activated (£—^) C homomeric heteromeric connexins connexons (B) connexon composed of six subunits ffl homotypic heterotypic intercellular channels JFigure 19-15. Molecular Biology of the Cellr 4th Edition. 2- Schematic djau.rajn Thawing the synthetic pathway of connexins and the assembly route into hom.oceLLu.Lar (between epitheLLaJ ceLLs or between. myoepitheLLaL cells'! or possible heterocellular ^between epithelial and myoepltbeJiaJ ceJLs) B.ap junctional (GT} structures, and their known binding partners. Connexins trafHc from, the ER to the GoJgi. Oonnex-ons pinch off in vesicles from the Golgl apparatus and are transported to the pLasma membrane where they align and dock with other connexons from the neighboring. ceJJ to form a gap junctional channel. The precise localization and manner of how connexin binding partners (I.e. Src_ ^-catenin, p-120 catenin, claudin. occJudin. and tubulin") associate with the C-terminus of connexin is not clear yet. Optimal mammary epithelial cell differentiation In a complex tissue environment requires the proper assembly of gap junctional plaques with their associated, proteins In addition to proper ceJJ/ECM Interactions. cell/cell adhesion, and soluble factor signaling, BM basement membrane. r ► HOMEOSTAZA rychlá rovnováha živin, iontů a tekutin ► ELEKTRICKÁ SPOJENÍ slouží jako el. synapse u neuronů, buněk hladkého svalstva, srdečních myocytů ► TKÁŇOVÁ ODPOVĚĎ NA HORMONY second messengers (Ca2+, cAMP, ceramid, IP3) procházejí ze stimulovaných buněk dále - šíření signálů v bun. populacích ► REGULACE EMBRYONÁLNÍHO VÝVOJE cesta pro chemické a elektrické vývojové signály Homologní a heterologní komunikace - mezi stejnými nebo různými buněčnými typy Změny v GJIC spojeny s kontrolou růstu, vývoje, diferenciace, apoptózy a adaptivní odpovědi j Růstově stimulační signál difunduje do sousedních buněk přes G J a dosahuje substimulační úrovně Model růstové kontroly prostřednictvím gap junctions (GJ) Růstově inhibiční signál Růstově stimulační signál difunduje do sousedních buněk přes G J a zabraňuje buněčnému dělení Signál dělení Gap Adherens Tight Junction Junction Junction Figure 5 Junctional complexes arranged in a nexus Gap junctions composed of connexins, adherens junctions consisting of cadhehns and tight junctions made up of occludins and claudins are often closely arranged in epithelial cells and share common bi nding proteins that scaffold to actin and microfilaments. Binding-protein-mediated cross-talk allows these three junctional complexes to act as a nexus and be governed by some common regulatory events. EXTRACELULARNI (mimobuněčná) MATRIX (ECM) ECM může ovlivňovat tvar, přežití a proliferaci buněk. Reciproční interakce mezi ECM a cytoskeletonem. Většina buněk musí být připojena k ECM, aby mohly růst, proliferovat a přežívat - závislost na substrátu (anchorage dependence) -zprostředkována integriny a jimi vybuzenými vnitrobuněčnými signály. Makromolekuly tvořící ECM jsou produkovány lokálně buňkami v matrix, které také pomáhaj í j ej í organizaci. Ve většině spojovacích tkání jsou makromolekuly matrix sekretovány fibroblasty (chondroblasty ve chrupavce, osteoblasty v kostech apod.) Dvě hlavní třídy molekul tvořících matrix: 1) Glykosamylglykany (GAG) - poly sacharidové řetězce z opakujících se disacharidových j ednotek většinou kovalentně vázány s proteiny - proteoglykany 4 hlavní skupiny - podle typu cukru, vazby mezi cukry a počtu a lokalizace sulfátových skupin: Hyaluronan, chondroitin sulfát a dermatan sulfát, heparan sulfát a keratan sulfát 2) Vláknité proteiny - kolagen, elastin, fibronektin, laminin -strukturální a adhezivní funkce Degradace komponent ECM - matrix metaloproteázy a serin proteázy Inhibitory metaloproteáz Tři způsoby organizace bazálni laminy MUSCLE Ibasal lamina connective tissue muscle cell plasma membrane EPITHELIUM LUMEN OR EXTERNAL SURFACE H ;onnective basal lamina tissue KIDNEY GLOMERULUS BLOOD endothelial celi URINE epithelial eel! basal lamina iFigure 19-55. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition. Souhrn spojovacích a nespojovacích adhezívních mechanizmů vazby savčích buněk navzájem a s ECM JTifWinnn act in filaments ]tight junction tdaudins) ]adhesion beat (Cadherins) 1 des mo some I (Cadherins) ]gap junction (connexins) Cadherins lg-líke CAMs integríns selectins X cc Z H O MA ESI ELL- ADH O integral membrane proteoglycan hemidesmosome focal adhesion (integrins) (integrins) Í w W JUNCTIONAL ADHESION NONJUNCTIONAL ADH MECHANISMS MECHANISMS integrmsl F^ure 19-32. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition. Souhrn různých buněčných spojení nalezených u epiteliálních buněk obratlovců junctional complex í •i* •í* actin intermediate filaments J L ^| name | function tight junction seals neighboring cells together in an epithelial sheet to prevent leakage of molecules between them adherens junction joins an actin bundle in one cell to a similar bundle in a neighboring cell desmosome joins the intermediate filaments in one cell to those in a neighbor junction allows the passage of small water-soluble ions and molecules h em i desmosome anchors intermediate filaments in a cell to the basal lamina basal lamina |Figure 15-19 part 1 of 2. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition,