Základy genomiky Přístupytfeverzní a přímé genetiky MASARYK UNIVERSITY JařrHejátko Masarykova univerzita, Laboratoř funkční genomiky a proteomiky Laboratoř molekulární fyziologie rostlin f(ďpMpi m I — I Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Základy génom ■ Zdrojová literatura ke kapitole III: Plant Functional Genomics, ed. Erich New Jersey Mello, C.C. and Conte Jr., D. (2004) Nature, 431,338-342. iky III. Grotewold, 2003, Humana Press, Totowa, Revealing the world of RNA interference. II I is y PYK UNIV-ERSIT"' Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Přístupy „klasické"genetiky versus „reversně genetický" přístup ve funkční genomice Arabidopsis thaliana NÁHODNÁ MUTAGENEZE •V „Přímě qeneticky"přístup EMS 1. IDENTIFIKACE FENOTYPU 2. GENETICKÉ MAPOVÁNÍ 3. GENOVÁ IDENTIFIKACE -poziční klonování „Reverzně geneticky" přístup T-DNA 1.IZOLACE SEKVENČNĚ SPECIFICKÉHO MUTANTA 2. IDENTIFIKACE FENOTYPU 3. PRŮKAZ KAUZÁLNÍ SOUVISLOSTI MEZI INZERCÍ A FENQfl&BEM Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Genomika III. Přístupy reverzní genetiky Metody identifikace sekvenčně specifických mutantů příprava sbírky mutantů vyhledávání sekvenčně specifických mutantů pomocí PCR vyhledávání sekvenčně specifických mutantů v vyhledávání sekvenčně elektronických databázích Analýza fenotypu a potvrzení příčinné souvislosti mezi fenotypem a inzerční mutací kosegregační analýza identifikace nezávislé inzerční alelv využití nestabilních inzerčních mutagenů a izolace revertantních linií Umlčování genů pomocí RNAi mechanismus účinku RNAi o & Mí 3 í Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky ■ ■ ■ Genomika III. Přístupy reverzní genetiky ■ Metody identifikace sekvenčně specifických mutantů příprava sbírky mutantů Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Typy inzerčních mutagenů Mobilní elementy autonomní transpozony (En-1) ■ obsahují gen pro transponázu, umožňující excizi a opětovné začlenění do genomu na obou koncích obsahují krátké obrácené repetice, které jsou transponázou rozpoznávány Stabilní elementy neautonomní transpozony (dSpm) mutant En/Spm transpozonu, který mutací v genu pro transponázu ztratil autonomii může být aktivován křížení transpozon linií nesoucí En/Spm T-DNA zcela stabilní, její inzerce však může chromozómovým přestavbám (inverze, transpozice) vést k delece, i. Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky • Vytváření knihoven inzerčních mutantů příprava transgenních rostlin vytvoření populace mutantních jedinců ia.ísĽ.'.^n T-, sunt 2P rijrtjf j^yciV: I i I Straší to* a lran£|»sfrd rvt-1 by PCR T4 x Columbia wilaiyťfl ISaniiliCaliflri oř \'j plonls wňlh 3 íHPípwwJ &t-f anfl 10T-DMA III II ^PůťSňts Gl1 Gří eajr G+fl G69 Single ^R*d dmsmnls of 51)0 prtxjeny [Inrriřiid Irani lho ľiirii |j.ircnls S, Gůnarallori niiiiiu vyhledávání sekvenčně specifických mutantů pomocí PCR F12K11 F12F1 F505 F28C11 F21H9 F16F11 F 309 ■ F19K23 " F 6021 I E?4A12 Distribution of En-insertions ■F1I2 ■F14I3 F3P11 F1SD1S. F12C20^ F4A13 F13P17. =► i F11L12 F14M4 ^ til ;2 F4K13 F24C8 ■F5B3 ♦FÍK F25A19-F14P3 - ■F28L23 "F27H1 "F6D2 "F6D1 IT22J4 -F16E6 -F12N1 = F^16 ■F16C19 ■ F4C21 F8J16 -F27K20 - F5K19 -F27023 : F27E6 - F16A16 F3F16 WÍh IV ■F16G1S -F5E1 -F28D22 -F6A4 -F9D12 F26D17. F23N5 | F22G8 ■ F9D9 , F8M3 ■ ^PW V Mb l- O -10 -15 -20 -25 Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Genomika III. Přístupy reverzní genetiky ■ Metody identifikace sekvenčně specifických mutantů příprava sbírky mutantů vyhledávání sekvenčně specifických mutantů ■ „trojrozměrné" vyhledávání pomocí PCR hybridizace s produkty iPCR na filtrech Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky „Trojrozměrné" vyhledávání pomocí PCR 1 .Knihovna En-7 inzerčních mutantů • autonomní En/Spm, bez selekce • 3000 nezávislých linií • průměrně 5 kopií na linii • trojrozměrné vyhledáváni pomocí PCR Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Genomika III. Přístupy reverzní genetiky „Trojrozměrné" vyhledávání pomocí PCR □ izolace genomové DNA z jednotlivých rostlin mutantní populace a vytvoření souhrnných souborů DNA („trojice", řady a sloupce trojic a jednotlivé podnosy) 3.000 mutantních linií A.t. (5 kopií En-"//linii) 28x3-tray pools pool 1......pool 28 mm mm ,ě9íwímÁwi LViV/J LVlVt, >%W»W tôWM W»W»V T T T 28 x 3 1-tray pools 28 x 7 row pools 28 x 5 column pools Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky i § § Genomika III. Přístupy reverzní genetiky ■ „Trojrozměrné" vyhledávání pomocí PCR □ izolace genomové DNA z jednotlivých rostlin mutantní populace a vytvoření souhrnných souborů DNA („trojice", řady a sloupce trojic a jednotlivé podnosy) □ identifikace pozitivní „trojice" pomocí PCR, blotování PCR produktů a hybridizace s genově specifickou sondou Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky „Třírozměrné" vyhledávání v knihovně inzerčních mutantů pomocí PCR 1. Vyhledávání pozitivní trojice 3.000 mutantních linií A.t. (5 kopií En-"//linii) 28x3-tray pools Xho67 1 f pool 1......pool 28 En-8130 _^ En-1 Xho67 En-205 En-205 1262 En-8130 (2x2x28=112 PCR reakcí) I Identifikace PCR produktu pomocí hybridizace s genově spec. sondou MASARYK UNIVERSIT"' Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky 1262 Genomika III. Přístupy reverzní genetiky ■ „Trojrozměrné" vyhledávání pomocí PCR □ izolace genomové DNA z jednotlivých rostlin mutantní populace a vytvoření souhrnných souborů DNA („trojice", řady a sloupce trojic a jednotlivé podnosy) □ identifikace pozitivní „trojice" pomocí PCR, blotování PCR produktů a hybridizace s genově specifickou sondou □ identifikace pozitivní linie pomocí Identifikace pozitivního „tácu", řady a sloupce Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky „Třírozměrné" vyhledávání v knihovně inzerčních mutantů pomocí PCR 1. Vyhledávání pozitivní trojice 3.000 mutantních linií A.t. (5 kopií En-"//linii) ■2. Identifikace linie nesoucí inzerci Xho67 1 f pool 1......pool 28 En-8130 _^ 3x1-1 En-1 Xho67 En-205 En-205 1262 pools M En-8130 (2x2x28=112 PCR reakcí) I Identifikace PCR produktu pomocí hybridizace s genově spec. sondou MASARYK UNIVERSIT"' Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky 1262 Genomika III. Přístupy reverzní genetiky ■ Metody identifikace sekvenčně specifických mutantů příprava sbírky mutantů vyhledávání sekvenčně specifických mutantů ■ „trojrozměrné" vyhledávání pomocí PCR hybridizace s produkty iPCR na filtrech Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Hybridizace s produkty iPCR na filtrech Inzerční knihovna dSpm mutantů ■ The Sainsbury Laboratory (SLAT-lines), John Innes Centre, Norwich Research Park ■ DNA a semena v Nottingham Seed Stock Centre ■ 48.000 linií ■ průměrně 1.2 izerce na linii ■ neautonomní transposon ■ PCR vyhledávání nebo hybridizace s iPCR filtry ■ SINS (sequenced insertion sites) databáze http://nasc.nott.ac.uk r < Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Přístupy reverzní genetiky Identifikace sekvenčně specifických mutantů ■ Hybridizace s produkty iPCR na filtrech □ izolace genomové DNA z jednotlivých rostlin mutantní populace □ štěpení restriční endonukleázou □ ligace, vznik cirkulární DNA □ inverzní PCR (iPCR) pomocí T-DNA specifických primem □ příprava nylonových filtrů s produlty iPCR v přesně daném vzorci (poloze) pomocí robota □ hybridizace s genově specifickou sondou Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Genomika III. Přístupy reverzní genetiky ■ Metody identifikace sekvenčně specifických mutantů příprava sbírky mutantů vyhledávání sekvenčně specifických mutantů pomocí PCR vyhledávání sekvenčně specifických mutantů v elektronických databázích Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky IHSk Sequencing of flanking sequence fragments Genomic DNA a) digestion with endonuclease Bfai b) linker ligation T-DNA linear "amplification" with primer annealing to T-DNA (mostly LB) PCR amplification with a nested T-DNA primer (and a linker primer) sequencing with another nested T-DNA primer Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Vyhledávání v elektronických knihovnách inzerčních mutantů Results of Blast search n gal n st sequenced inserts ?In.=ert_SAĽK : D393L1: Ordar lina 029311 | V i ay in AGJ! Length - J £ D ScDrc - 1B1 bits í3-41] , Expect - c-135 Identities - 250/353 <99t} Strand - Plus / Minun Query: 11BQ aLta.ga.gLttgattgaajgtgtgttttatatittgatngLgggncnttactt-a.t-3.a-a.aagc L5D9 M M M M M M n M M i M M M n M M M M M M M n i M M M M M M M Ebjct: 159 aLtagagttLgattgaajgcgcgtt ttatatatLgatagtgggacatta.cLta.ta.aa.aa.gc JQD Query: 15LQ acaaggaLacaacaaLagagacagLcacatgtatatcacataagLggatggtcctcaatg L5E9 IIII M IIIIII MIMI II i II MIMI IIIIII M II MIMI IIIII llllllll II EbjcL: 399 acaagga tacaacaatajgagacagtcacatgtat at cacataagtggatggtcctcaatg 21D Quecy: 157Q tgttgcttgLaggacatLtgtgagtaLgLcaaaaacLtatttcacatggLacactcaLag 1-329 ll ll llll ll ll ll llll ll I ll llll ll ll ll llll ll ll ll ll I ll ll ll ll llll ll EbjcL: 339 tgttgct tgLajggacat Ltgt gagtaLgLcaaaaacLtat Lt cacatggLacactca Lag 2-9D Quecy: 1630 aLtagccccacttaggagtgtctagaaaaagaLtgggactaaagtcttgLtggatcgaat ll ll llll ll ll ll llll ll I ll llll ll ll ll llll ll ll ll ll I ll ll ll ll llll ll EbjcL: 279 a Ltagccccactt aggajgtgt ctagaaaaagaLtgggact aaagtct tgLtggatcgaa L 23D Quecy: 1É90 aLgattccaaac L7D1 llllllllllll EbjcL: 219 aLgattccaaac 2GĚ ScDrc - 111 bita Í5EJP Eicpect - Be-22 Identities - 77/B1 Í91*> Strand - Plus /' Plus Query: 1923 tacattttctcgctacaattaaegctatcaatatatttataaaaccatttgtcatttcac L9Ě2 IIIIIIIIIIII MM III III 111111111111111111111 I I llllllll Ebjct: 13 tacattttcLcgcLacgattgacggtatcaatatatttataaaaccgtccgacatttcac 72 Quecy: 19B3 ttecttaactantcacataaatga 2D0E IIIIIIIIIIII MIMI IIIIII Ebjct: 73 ttccttaactaatcacataaatga 9£ Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Vyhledávání v elektronických knihovnách inzerčních mutantů r lin^ C^Sll I Vij Smíc - iii bit» (241J . Exp pí Identitiea - (3S1> Strand - Plna / Miniu Ju c L-y : 14 BO l-i 11 i "j i "j 111 j o í t -j o j -■ \ -j -. -j 1111 j t j t j 11 "j l-i t l-mj t "j 3"j l-i r Eb j ct: i S 5 □ ttagag 111 >j ^ ly. -j ^ j j ľ -j 1111 j l a l j l t q a l ag tggg ac : ta.c tta.ta.aa.aa.gc 1SD9 II II II II II II II LictLiLíůíůigc 300 Query: 1510 .iľúvj: Ebjotz 399 acaagc ■ ■ " :■. : : : ■ -J. " ■ : ■ ■ " II IIII II II I II II II II II II II t .' .i ■' .i'. j Ľi'J t "J "J i t ^'J t íľ ~ l ~a a l g ] □nery: 157Q tgtLg^tLgLa^gacatttgtg-a.gtatgtc-a.a-a.aact.tatt.tc-3ca Lg^tararLratag 1 EbjcĽ: 335 tgttgctLgLajggncntttgtg-agtůtgtcaůaiůcttůtttcic-itggtůcactcatag I £b j rt : 279 at tagrcrrart tů.jgagtgtcta-7]aaaaa-7]ai: tg.jgícLůíůijt rLtjt Lgg-a.tcg-iat I QutL-y: IS SO atQattcraaac 1701 EbjcĽ: 215 aLgat start transkripce T-DNA Eddie - 111 biti id=nti.ti=n - n/a BtrajiÄ - Piu. / Pli JuíL-y: 19:; LiC.it>. EbJDĽ: 13 ticitl 1923 icactcgatttcacattAATTATTCACT nmnnnnnnnnnn itrgrtscsuLtídľijľLsLľí] i m m m m m m m n rtcgct-icgattgacg-^t-itcaa acatjiaatga 2DQĚ taaaaccatttgtcilt l-ac I II II II I I I II II II II t aaaaccgtccgacat ttca c " + gtgactaaagtgtaattaataagtga......... V. -• " Gl F G2 1Mb (+56) I Exon Intro n Tran smembranová oblast Duplikace ^^^H En-i element Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Genomika III. Přístupy reverzní genetiky Metody identifikace sekvenčně specifických mutantů příprava sbírky mutantů vyhledávání sekvenčně specifických mutantů pomocí PCR vyhledávání sekvenčně specifických mutantů v vyhledávání sekvenčně elektronických databázích Analýza fenotypu a potvrzení příčinné souvislosti mezi fenotypem a inzerční mutací kosegregační analýza identifikace nezávislé inzerční alelv využití nestabilních inzerčních mutagenů a izolace revertantních linií o & Mí 3 í Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky ■ Proč je nutné analyzovat příčinnou souvislost mezi inzercí a pozorovaným fenotypem ? přítomnost více inzercí v jedné linii možnost vzniku nezávislé bodové mutace s inzercí T-DNAjsou často asociovány chromozómové aberace a přestavby (duplikace, inverze, delece) II I is j RYK UNIVERSIT"' Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Genomika III. Kosegregační analýza kosegregace specifického fragmentu např. po inzerci T-(nebo působení EMS atd.) do genomu s pozorovaným fenoty + + + + + + + + + ■ Využití autonomních transpozonů pro izolaci nových stabilních mutací a revertantních linií transpozony se často vyznačují excizí a reinzercí do blízké oblasti-využití při izolaci nových mutantních alel excize transpozonů není vždy zcela přesná-vznik bodových mutací - izolace revertantních linií s tichou mutací i stabilních mutantů Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Fenotyp šešulí cki1::En-1ffl mm Potvrzení fenotypu cki1::En-1flH 1. Izolace revertantních linií I • PCR vyhledávání ve 246 rostlinách segregující populace ' • z 90 cki1::En-1 pozitivních 9 rostlin mělo kromě šešulí standardního typu i šešule mutantní Analýza potomstva • potvrzení absence inzerce pomocí PCR • PCR amplifikace a klonování části genomové DNA v místě inzerce sekvenování r < Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky • Využití autonomních transpozonů pro izolaci nových stabilních mutací a revertantních linií Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Potvrzení fenotypu cki1::En-1flH 2. Izolace stabilní mutantní linie ► analýza fenotypu segregující populace ($7/87QX/cki 1 ::En-1) • PCR analýza rostlin s mutantním fenotypem-identifikace rostlin bez inzerce • PCR amplifikace a klonování části genomové DNA v místě inzerce • sekvencování Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Využití autonomních transpozonů pro izolaci nových stabilních mutací a revertantních linií aattcaagt^pACTACAAGA En-1 TCTTGTAGTGcgtggagačt A. aat tca ag N S S cgt^ggagac tac R G D Y act tgg tac act caa acc gtg gat cag tta act ggt TWYTQTVDQLTG B. aat tca agt ggt acg act tgg tac act caa acc gtg gat cag tta act ggt N S S |G TI T W Y T Q T V DQ L T G C. aat tca ag N S S D. aat tca ag N S S cgt acg R T ]ag act aca ctt ggt aca ctc aaa ccg tgg atc agt taa E T TLGT L K PWIS cgc gtg R V jag act aca ctt ggt aca ctc aaa ccg tgg atc agt taa ETTLGTLKPWIS. Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Genomika III. Přístupy reverzní genetiky ■ Metody identifikace sekvenčně specifických mutantů příprava sbírky mutantů vyhledávání sekvenčně specifických mutantů pomocí PCR vyhledávání sekvenčně specifických mutantů v elektronických databázích ■ Analýza fenotypu a potvrzení příčinné souvislosti mezi fenotypem a inzerční mutací identifikace nezávislé inzerční alely využití nestabilních inzerčních mutagenů a izolace revertantních linií ■ Umlčování genů pomocí RNAi mechanismus účinku RNAi Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Genomika III. mechanismus RNA interference ■ Molekulární podstata posttranskripčního umlčování genů (PTGS) RNAi objevena uCbenorhabditis elegans umlčování bylo indukováno jak sense tak antisense RNA (pravd', kontaminace obou při in vitro transkripci) dsRNA indukovala umlčování cca 10-100x účinněji ■ dsRNA indukce je závislá na vlastních genech-gen. vyhledávání RNAi rnai Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Genomika III. mechanismus RNA interference ■ Molekulární podstata posttranskripčního umlčování genů (PTGS) RNAi objevena uCbenorhabditis elegans je to přirozený mechanismus regulace genové exprese u všech eukaryot podstatou je tvorba dsRNA, která může být spuštěna několika způsoby: ■ přítomnost cizí „aberantní" DNA ■ specifické transgeny obsahující obrácené repetice částí cDNA ■ transkripce vlastních genů pro shRNA (short hairpin RNA) nebo miRNA (micro RNA, endogenní „vlásenková" RNA) dsRNA je procesována enzymovým komplexem (DICER), což vede k tvorbě siRNA (short interference RNA), která se pak váže buď na enzymový komplex RITS (RNA-induced transcriptional silencing complex) nebo RISC (RNA-induced silencing komplex) RISC zprostředkovává buď degradaci mRNA (v případě úplné similarity siRNA a cílové mRNA) nebo vede pouze k zastavení translace (v případě neúplné homologie jako je tomu např. v případě miRNA ^^^^1- RITS zprostředkovává reorganizaci genomové DNA (tvorba heterochromatinu a inhibice transkripce) Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Genomika III. mechanismus RNA interference Multigene family or Foreign DNA (naked! repetitive Iransgene Foreign dsRNA Developmental or experimental transcription Transgene assembřy/ DNA/chromatin modification shRNA pre-miRMA short hairpin RNA micro RNA Intermediate LLLLLL siRNA J-(^m m iRKA /■ 77 /TN Mirninnii RTTS RTTS Materachromatin formation and transcriptional silencing mRNA destruction or translations! repression etiky Mello, 2004 \ / MASARYK UNIVERSIT"' 7712 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006 "for their discovery of RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA" USA Stanford University School of Medicine Stanford, CA, USA b. 1959 USA University of MassacjsJ0sette3 Medical School (f <&stüi Worcester, MA, ud&SiS&EŽ b. 1960 Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Mechanizmus posttranskripčního umlčování genů pomocí RNA interference (iRNA) Highly transcribed single-copy transgene loci Cffe CH] CHa ^- Viruses vims transĽeiie OR F virus Plo 1 traiisíieiie O R F /metiX trans sene ORF- Inverted-repear transgene loci -k CHj CHj CHj CHj Oíj CH3 CH3 CH3 CH3 ■tiíin&Lene ORF antisense llllilll sense dsRNA uidA RISC-like (inRNA-de^iacĽiti o n complex^ Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Eco Rl §ac I Sacll ISIotl Xbal Bgl II 13226^ Sacll 12826,. Bgl II 10526, EcoRI 10286. Pst I 10248. Nde J 10076' jSpel Nhel Clal SM .Sal I 864 < OP910 Ri?W^ 'Hind "' 1252 Gay V mín CKIp2A GUSp 3amHI2196 lind III pVKH::(BOP::CKli2::pA) 13426 bp CKIp2S y)f ^Sal I 2596 Hinc II pA *Xxhoi RB -^^_\sApa I Sph I 3336 Sacll 4206 Kpn I 7926 Apa I 5496 Not I 5906 Xho I 791 Nde I 6476 3la I 6606 Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky Genomika III.-shrnutí Přístupy reverzní genetiky Metody identifikace sekvenčně specifických mutantů příprava sbírky mutantů vyhledávání sekvenčně specifických mutantů pomocí PCR vyhledávání sekvenčně specifických mutantů v vyhledávání sekvenčně elektronických databázích Analýza fenotypu a potvrzení příčinné souvislosti mezi fenotypem a inzerční mutací kosegregační analýza identifikace nezávislé inzerční alelv využití nestabilních inzerčních mutagenů a izolace revertantních linií Umlčování genů pomocí RNAi mechanismus účinku RNAi o ŕ/ Mí 3 í Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky ■ ■ ■ Genomika III.-diskuse Přístupy reverzní genetiky Základy genomiky III, Přístupy reverzní a přímé genetiky