Základy genomiky IV. Metody funkční genomiky ŕ/ MASARYK UNIVERSITY JařrHejátko A/ ^ ^ Masarykova univerzita, Laboratoř funkční genomiky a proféo^k^4 Laboratoř molekulární fyziologie rostlin j| Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Základy genomiky IV. Zdrojová literatura ke kapitole IV: Plant Functional Genomics, ed. Erich Grotewold, 2003, Humana Press, Totowa, New Jersey Surpin, M. and Raikhel, N. (2004) Traffic jams affect plant development and signal transduction. Nature Reviews/Molecular Cell Biology 5,100-109 Zouhar, J., Hicks, G.R. and Raikhel, N.V. (2004) Sorting inhibitors (Sortins): Chemical compounds to study vacuolar sorting in Arabidopsis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A., 101, 9497-9501 Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. Analýza genové exprese Metody kvalitativní analýzy genové exprese Metody identifikace funkce genů pomocí přístupů získané funkce T-DNA aktivační mutageneze ektopická exprese a systémy regulovatelné genové exprese Fenotypové profilovaní DNA a proteínové čipy metabolické profilovaní metódy mikrodisekce ■ Metody využívané ve funkční genomice rostlin A. thaliana jako modelový organizmus funkční genomiky rostlin príprava transgenních rostlin ^^^H- Southern blot a DNA molekulárni hybridizace ^^^H- izolace genomové DNA, PCR o ŕ/ *(* • i — m m m Základy genomiky IV., Metody funkčni genomiky Genomika IV. ■ Nové trendy chemická genetika Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. analýza genové exprese ■ Metody analýzy genové exprese Kvalitativní analýza exprese genů Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s reportérovým genem (gen zpravodaj) Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. analýza genové exprese □ Transkripční fůze s promotorovou oblastí Identifikace a klonování promotorové oblasti genu příprava rekombinantní DNA nesoucí promotor a reportérovy gen (uidA, GFP) příprava transgenních organismů nesoucích tuto rekombinantní DNA a jejich histologická analýza 5' UTR TATA box promotor .--Jr-~ počátek transkripce BamHI GAGGAGGCACAAAATGACGAA -//- tgtattcttttgttatcaaagggtttcgactttgctccgaggaagaagataatatgaggatcccccgggtaggtcagtcccttatgttacgtcctgtagaaaccccaacc -2739 // @ r 1 prvgqslmlr [ ©k raf ] JJmmvkvtk ...S BamHI GAGGAGGCACAAAATGACGAA -//- gttatacaagttcactcaaatgatggtgaaagttacaaagcttgtggcttcacgtcggatcccccgggtaggtcagtcccttatgttacgtcctgtagaaaccccaacc MMVKVT KLVAS R Rl PRVGQSLMLRPVETPT - intron I exon Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. analýza genové exprese ■ Metody analýzy genové exprese Kvalitativní analýza exprese genů ■ Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s reportérovým genem (gen zpravodaj) Příprava translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s reportérovým genem Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. analýza genové exprese □ Translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s repotérovým genem Identifikace a klonování promotorové a kódující oblasti analyzovaného genu příprava rekombinantní DNA nesoucí promotor a reportérovy gen (uidA, GFP) ve fůzi s reportérovým genem příprava transgenních organismů nesoucích tuto rekombinantní DNA a jejich histologická analýza TATA bo>PprotPt^Tfékripčr^ ir\iu \[Ji uicii iu) i icuu jci iu promotor počátek transkripce GAGGAGGCACAAAATGACGAA -//- tgtattcttttgttatcaaagggtttcgactttgctccgaggaagaagataatatgaggatcccccggg| @ R I P R histone 2A-GFP in Drosophila embryo b> Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. analýza genové exprese ■ Metody analýzy genové exprese Kvalitativní analýza exprese genů ■ Příprava transkripční fůze promotoru analyzovaného genu s reportérovým genem (gen zpravodaj) ■ Příprava translační fůze kódující oblasti analyzovaného genu s reportérovým genem ■ Využití dostupných publikovaných dat Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. analýza genové exprese Analýza exprese pomocí Genevestigator (AHP a AHP2, Arabidopsis, Affymetrix AT H 22KArray) Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. ■ Analýza genové exprese Metody kvalitativní a kvantitativní analýzy genové exprese ■ Metody identifikace funkce genů pomocí přístupů získané funkce T-DNA aktivační mutageneze ektopická exprese a systémy regulovatelné genové exprese Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. ■ Metody identifikace funkce genů pomocí přístupů získané funkce T-DNA aktivační mutageneze metoda umožňující izolaci dominantních mutantů prostřednictvím náhodné inzerce konstitutivního promotoru, vedoucí k nadměrné expresi genu a tím odpovídajícím fenotypovým změnám prvním krokem je příprava mutantní knihovny připravené pomocí transformace silného konstitutivního promotoru nebo zesilovače Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. aktivační mutageneze ľ40Š: Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Izolace genu CK/7 Tatsuo Kakimoto, Science 274 (1996), 982-985 izolace genu pomocí aktivační mutageneze - mutantní fenotyp je fenokopií exogénni aplikace cytokininů (CKI1, CYTOKININ INDEPENDENT t-zeatin Plasmid K2 35S::CK1 rescue cDNA A > " tab}** A ' A hormones • x .-R 1) K1 no Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. ■ Metody identifikace genů pomocí přístupů získané funkce T-DNA aktivační mutageneze ektopická exprese a systémy regulovatelné genové exprese Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. Systémy regulovatelné genové exprese umožňují časovou nebo místně specifickou regulaci genové exprese, vedoucí ke změně fenotypu a tím identifikaci přirozené funkce genu pOP systém ■ ■ Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. systémy regulovatelné exprese, pOP Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. systémy regulovatelné exprese, pOP Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. systémy regulovatelné exprese +DEX 35S activator X activator x reporter wt Col-0 TATA pOP «Al TATA pOP LhGR CKI1 GUS Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky 4C Genomika IV. Systémy regulovatelné genové exprese ■ umožňují časovou nebo místně specifickou regulaci genové exprese, vedoucí ke změně fenotypu a tím identifikaci přirozené funkce genu ■ pOP systém ■ UAS systém http://www.plantsci.cam.ac.uk/Haseloff/ Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. ■ Metody identifikace genů pomocí přístupů získané funkce T-DNA aktivační mutageneze ektopická exprese a systémy regulovatelné genové exprese ■ Fenotypové profilování DNA a proteinové čipy Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. ■ Fenotypové profilování DNA a proteinové čipy metoda umožňující rychlé porovnání velkého množství genů/proteinů mezi testovaným vzorkem a kontrolou nejčastěji jsou používané oligo DNA čipy ■ ■■ i ... „ „ AffymetrixATHI Arabidopsisaenome array k dispozici komerčně dostupné sadv pro celv crenom_ _ J C rit kal Sp«ificatioin íe.173 genů Aiabidopsis t Number oF arrjTys Number oF sequence represented j>24,Ü0Ü gene &equencea Ol ige nucleotide probe length možnost poj^ggg^s^a mm ■ I ^M3KŕúFWm\ I.I i l.d KTITTiIJKTIpTJIH I syntézy oligo touto technik Detection aenaitivity £ colt genea bioB, bioQ bioD. B. subtHts gene lysA. Fhage PI ere gene. Arabidopaia maintenance genea GAFDH, Ubiquitin, and Actin 1:100,00 0* -As measured by detection In comparative analysis between s complex target contslnlng Eplked control transcrl pflons and s complex target with no spikes. ^čipy ŕräjen pro analýzu exprese, ale např. i genotypování tSNFpolymorfizmy, sekvenování pomocí čipů, ...) fr 3\¥ m Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. DNA čipy DNA čipy, analýza výsledků pro správnou interpretaci výsledků je nutná dobrá znalost pokročilých statistických metod je nutné zahrnout dostatečný počet kontrol i opakování kontrola na přesnost měření (opakované měření na několika čipech se stejným vzorkem, vynesení stejných vzorků analyzovaných na různých čipech proti sobě) kontrola reproducibility měření (opakované měření s různými vzorky, izolovanými za stejných podmínek na stejném čipu-stejné podmínky proti sobě) identifikace hranice spolehlivého měření konečně vynesení experimentu proti kontrole nebo různých podmínek proti sobě - vlastní výsledek I e3 IBS1I v současnosti je již velké množství výsledků různých experimentů lokalizovaných ve veřejně přístupných databázích che et al., 2002 ■ Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. proteinové čipy ■ Proteinové čipy čipy s vysokou denzitou obsahující řádově 104 proteinů analýza protein-proteinových interakcí, substrátů kináz a interakcí s malými molekulami možnost použít protilátky - stabilnější než samotné proteiny Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. proteinové čipy Identifikace proteinů interagujících s cytoplasmatickou částí integrinu aMbp3 krevních destiček exprese cytoplasmatické části jako fůzního peptidu biotin-KVGFFKR analýza vazby s proteinovým čipem obsahujícím 37.000 klonů E.coli exprimujících lidské rekombinantní proteiny potvrzení interakce pull-down analýzou peptidů i koprecipitací celých proteinů (chloridový kanál ICIn) další využití např. při identifikaci substrátů kináz, kdy substráty jsou navázány na čip a vystaveny působení kináz za přítomnosti radiokativně značeného ATP (768 purif. proteinů ječmene, z nich 21 identifikováno jako subtráty kinázy CK2a, Krameretal., 2004) ■ Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. Metody identifikace genů pomocí přístupů získané funkce T-DNA aktivační mutageneze ektopická exprese a systémy regulovatelné genové exprese Fenotypové profilování DNA a proteinové čipy metabolické profilování metody mikrodisekce proteomické přístupy Metody využívané ve funkční genomice rostlin A. thaliana jako modelový organizmus funkční genomiky rostlin příprava transgenních rostlin H- PCR O & Mí 3 í ■ Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Arabidopsis thaliana huseníček polní, mouse-ear cress malé nároky na kultivační plochu velké množství semen (20.000/rostlinu a více) malý a kompaktní genom, (125 MBp, cca 25.000 genů, prům. velikost 3 kb) 5 chromozomů vhodná pro široké spektrum fyziologických experimentů velká přirozená variabilita (cca 750 ekotypů (Nottingham Arabidopsis Seed Stock Centre)) N1092 o Columbia 0 Landsberg G Wassilewskija G m i — http://seeds.nottingham.ac.uk/ Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky ■ ■ Arabidopsis, významný rostlinný model Počet záznamů v databázi „PubMed" (MEDLINE) vyhledaných pod heslem „Arabidopsis11 25.690 (16.10. 2008). (Pro srovnání, pod heslem „human" nalezeno 10 620 405 záznamů). Arabidopsis Publications NumbBT of Publications 33jjJ 2H I—I n 1985 "ISM 1987 1938 1989 1990 1991 1992 1993 1994 Vur National Science Foundation, USA,", http://www.nsf.gov/bio/pubs/arabid/chap1.htm Database name Direct links Protein Structure Genome Popset SNP jL) Domains GEO Datasets GEO Expressi ons 61,406 UniGene UniSTS PubMed Centr al Gene Taxonomy MASAPYI^ WER TAIR, http://www.arabidopsis.org/info/aboutarabidopsis.jsp Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky 33 C Hm :;H 1399 Hind 111 1345 Agrobacterium mediated plant transformaHpn hol Mine II pa i Sph I 2328 \Sacll 3198 Eco RI 9278 Pst I 9240' Nde I 9068' Apa I 4488 Ot I 4898 Kpn I 691 í Xho I 69081 Nde I 5468 la í 5598 Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Transformace kokultivací listových disků Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Transformace kokultivací kalusů Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Transformace „nastřelováním" DNA Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky PCR Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. Nové trendy chemická genetika pojem chemická genetika - více než 50.000 záznamů v databázi PubMed (16.10. 2008) ]S]Cßl I MDlL M[3íl |iaaiD(iiasHai ad. ťIb H-ľfomlIďlitnfať of Ifcalfli IďlIlIIIĽ^ďl All DuDSä PüQH«d hliictecckd Gtnorťi* So-lkcu-í OMJM PMC -t'ü-n-ab; SPSS S3JĚ 5h 3 Tut i Labeled f of Pit. b it K-lŤ^Ti T '"Tri TiT hni Y. EM* L Re írt d A rtfcfeí, Lühs Five cases ofb eta-ureidopropdoriase deficierĽY detected by G C/M S analysis of urine metabolome. SpKl» hl 2 OOS Oct 1+. p pub lii-i-l o fpriufl PHID: 1SSJ3+77 [PtAHďí - * ruppüd lyF*1^1*1] A coreerrai C-terrranal thirteenarrano acid motif of Gapl is requited for the Gap 1 Junction and necessary fbrbiogenesis of aserine-rich glycoprotein of S treptococois parasariguňús. Ig&ůŤT-mTiťniL 200S CttlJ . [Eprib iLi-i-1 of prinf] PMID: 1SSJ22+9 [PtAMďí - * ť-applil TyP*1^1*1] Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. chemická genetika ■ Analýza mechanismů endomembránového transportu přístupy chemické genetiky v rostlinných buňkách dochází k velice dynamickým procesům, zprostředkovávaným zejména tzv. endomembránovým transportem (viz film, GFP směřované do ER) Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. chemická genetika Analýza mechanismů endomembránového transportu přístupy chemické genetiky pomocí vyhledávání v „knihovně" chemických látek byly identifikovány takové, které vedou u kvasinek (S. cerevisiae) k sekreci enzymu (karboxipeptidázy Y), která je normálně transportována pomocí endomembránového transprtu do vakuoly ■ analýza změny sekrece pomocí dot-blotu a imunodetekce karboxipeptidázy Y v kultivačním médiu pomocí monoklonálních ^^^^ protilátek ■■■■■■■■P identifikované látky („sortiny") byly schopny vyvolat obdobné změny i u >4raĎ/Gřops/s_(konzervované mechanismy transportu u kvasinek i u rostlin) / " pro bližší identifikaci moleklHPPffM ovlivněného jedním z identifikovaných „sortinů" byla B provedena analýza jeho vlivu na sekreci markerového proteinu (AtCFjjÉÉipíM tuto sekreční VfPl^ . "V * ■ ■ pomocí EMS mutageneze identifikace mutantů se změněnou citlivostí k sortinu 1 (hyper- nebo hypo-senzitivní mutanti) Zouhar et aI., 2004 ■ Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. chemická genetika Analýza mechanismů endomembránového transportu pomocí chemické genetiky - shrnutí GFP::d-TIP značení mebrány vakuoly (tonoplastu) a identifikace mutací vedoucí ke změně morfologie tonoplastu chemická genetika v kombinaci s klasickou genetikou identifikace proteinů zúčastňujících se regulace endomembránového transportu proteomické přístupy - identifikace a analýza proteomu vakuol ■ Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. Shrnutí Metody identifikace funkce genů pomocí přístupů získané funkce T-DNA aktivační mutageneze ektopická exprese a systémy regulovatelné genové exprese Fenotypové profilování DNA a proteinové čipy metabolické profilování metody mikrodisekce Metody využívané ve funkční genomice rostlin A. thaliana jako modelový organizmus funkční genomiky rostlin příprava transgenních rostlin H- PCR O ŕ/ *(* • i — ■ Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. Shrnutí ■ Nové trendy chemická genetika Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky Genomika IV. Diskuse Základy genomiky IV., Metody funkční genomiky