SYNTETICKÉ OLIGONUKLEOTIDY Hana Konečná CENTRÁLNÍ LABORATOŘ Masarykovy Univerzity v Brně Oddělení funkční genomiky a proteomiky Přírodovědecká fakulta Masarykovy university ODDĚLENÍ FUNKČNÍ GENOMIKY A PROTEOMIKY Laboratoř analýzy biologicky významných komplexů Centrální laboratoř CL Laboratoř molekulární fyziologie rostlin CENTRÁLNÍ LABORATOŘ * přístup k pokročilým technologiím na bázi sdílené instrumentace a její kvalifikované obsluhy proteomické techniky genomické techniky * výuka - přednášky a praktické kurzy * členství v ABRF (Association of Biomolecular Resource Facilities) TECHNIKY V CENTRÁLNÍ LABORATOŘI * sekvenování a fragmentační analýza DNA * syntéza a purifikace oligonukleotidů * kapalinová chromatografie * gelová elektroforéza * analýza obrazu * digesce proteinů * hmotnostní spektrometrie * minisklad reagencií pro molekulární biologii SYNTETICKÉ OLIGONUKLEOTIDY * definice * aplikace * modifikace * syntéza * purifikace * kontrola kvality * design sekvence * zásady navrhování * software OLIGO 6 * praktická ukázka oligonukleotid * krátká jednořetězcová struktura * DNA nebo RNA (event. PNA) * hydroxyl na obou koncích oligonukleotid syntetický oligonukleotid primer Aplikace syntetických oligonukleotidů * konstrukce duplexů * primery pro syntézu komplementární DNA PCR, Real-Time PCR * hybridizační sondy pro klonování * místně cílená mutageneza * strukturální rentgenová analýza NA * NMR studia interakcí DNA-protein * potenciální léčiva * gene arrays Modifikace * degenerace * konce řetězce * báze * fosfát * cukr * PNA Degenerované oligonukleotidy M A or C R A or G W A or T S C or G Y C or T K G or T V A or C or G H A or C or T D A or G or T B C or G or T N G or A or T or C X G or A or T or C 2-deoxyinosin ? univerzální báze: 3-nitropyrrol ? 5-nitroindol ? www.glenres.com Modifikace na 5´- konci sekvenování fragmentační analýza gene arrays Real-Time PCR postsyntetické modifikace Modifikace na 3´- konci derivatizovaná matrice Real-Time PCR * 2x značená sonda * REPORTER * QUENCHER Další modifikace páteř cukr Terapeutika nedegradována nukleázami! modifikace fosfodiesterové vazby ANTISENSE oligonukleotid * oligonukleotid nebo analog * komplementární k segmentu RNA nebo DNA * vazbou inhibuje jejich normální funkci Peptidonukleová kyselina N-(2-aminoethyl)-glycin N-terminal C-terminal 5´-end 3´-end PNA DNA * nenabitá molekula * vazba k DNA/RNA PNA Peptidonukleová kyselina N-(2-aminoethyl)-glycin N-terminal C-terminal 5´-end 3´-end PNA DNA * nenabitá molekula * vazba k DNA/RNA PNA Vlastnosti PNA Locked Nucleic Acid 2'-O, 4'-C methylenový můstek potlačená flexibilita ribofuranózového kruhu struktura je zamčena do rigidní C3-endo konformace zlepšená hybridizace výjímečná biostabilita LNA T-LNAdmf-G-LNA5-Me-Bz-C-LNABz-A-LNA Syntéza oligonukleotidu ˇ organická syntéza na pevné fázi * od 3´-konce k 5´-konci * bezvodé prostředí OLIGONUKLEOTIDY design syntéza purifikace EXPEDITE 8909 Kontrola kvality * anex * RP HPLC Perfúzní chromatografie Perfúzní chromatografie POROS klasický sorbent POROS Maldi-Tof MS CE PAGE Sephadex RP cartridge HPLC PURIFIKACE Odsolování * soli * oligonukleotid http://www.sci.muni.cz/FGP DESIGN OLIGONUKLEOTIDU * manuální * počítačový HLAVNÍ ZÁSADY NAVRHOVÁNÍ SEKVENCE * vysoce specifické * netvoří dimery a hairpins * stabilní duplexy s aktivní sekvencí * nepříliš stabilní 3´-konec http://bip.weizmann.ac.il/bio_tools/primers.html 5´ 3´ 5´3´ 5´ 5´ UPPER - FORWARD - LEFT LOWER - REVERSE - RIGHT - + PRIMING EFFICIENCY 360 velmi vysoká 340 vysoká 320 střední 310 uspokojivá 300 nízká 290 velmi nízká DUPLEX ˇ DIMER intermolekulární * HAIRPIN intramolekulární PRAKTICKÁ ÚLOHA Consensus primer * CODEHOP Consensus-Degenerate Hybrid Oligonucleotide * pro rozdílné proteinové sekvence vyžadující degenerované primery * CORE 3´- oblast 11 ­ 12 bp degenerovaná * CLAMP 5´- oblast nedegenerovaná, délka dle požadované annealing teploty, obvykle 20 ­ 30bp * specifický během časných cyklů * selektivní v pozdních cyklech http://blocks.fhcrc.org/codehop.html OBJEDNÁVKY www.sci.muni.cz/FGP * on-line * e-mail * písemně