B7201 - Základy genomiky, cvičení 1 DEN1 VYBRANÉ METODY VYUŽÍVANÉ K STUDIU GENOMU ARABIDOPSIS THALIANA A K PROVÁDĚNÍ CÍLENÝCH ZMĚN, SYNTÉZA A PURIFIKACE OLIGONUKLEOTIDU Úvod Dopolední část bude věnována analýze aktivity promotoru pomocí transkripční fůze a praktickému osvojení software pro design sekvence oligonukleotidu OLIGO 6 včetně navržení sekvence PCR primerů, odpolední část zahrne vlastní syntézu, purifikaci a kontrolu kvality PCR primem. Časový harmonogram 8:30 PRÍPRAVA MATERIÁLU (Jan Hejátko), laboratoř 334 8:45 ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ TRANSKRIPČNÍ FŮZE 1. Teoretický úvod 2. Zahájení barvení 10:30 DESIGN SEKVENCE OLIGONUKLEOTIDU (Hana Konečná), místnost 211 12:30 ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ TRANSKRIPČNÍ FŮZE 3. Kontrola GUS barvení/zahájení odbarvování 12:45 OBĚD 13:45 ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ TRANSKRIPČNÍ FŮZE 4. Kontrola GUS barvení/zahájení odbarvování 14:00 SYNTÉZA OLIGONUKLEOTIDU (Hana Konečná), Centrální laboratoř 342 17:00 ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ TRANSKRIPČNÍ FŮZE 5. Zahájení odbarvování vzorků 17:15 UKONČENÍ PROGRAMU 1. DNE Příprava materiálu Pro práci v laboratoři se seznámíme s organizací práce, přístroji a připravíme materiál a roztoky. Práce v laboratoři • Bezpečnost • Zdroje vody • Základní chemikálie • Odměřování a pipetování • Skladování 1 jednotlivé časy se mohou měnit podle potřeby a rychlosti zvládnutí jednotlivých metod Verze: 1. 12. 2008 B7201 - Základy genomiky, cvičení 2 • Odpady a použitý materiál • Sterilizace Přesvědčte se, že máte k dispozici následující chemikálie a materiály: • ddH20 (sterilní, 50ml) • 70% etanol / 100% etanol • Spičky/zkumavky (sterilní) Komponenty PCR reakce. V krabičce označené číslem vaší skupiny jsou uložené následující chemikálie: • Taq DNA polymeráza • lOx koncentrovaný PCR pufr s MgCl2 • dNTP • primery Metoda 1A Analýza aktivity promotoru pomocí transkripční fůze s reportérovým genem uidA (GUS) 1) Rozpipetujte si připravený barvící roztok do barvící destičky (2 ml) 2) Vložte připravené semenáčky (cca 10-15 kusů) pomocí jemné pinzety do barvícího pufru 3) Proveďte infiltraci v exsikátoru (15 min.) 4) Vložte do termostatu (37 °C). 5) V cca dvouhodinových intervalech provádějte kontrolu barvení pomocí stereomikroskopu. 6) Barvení zastavte pomocí 80 % etanolu, ve kterém ponechejte semenáčky odbarvovat při pokojové teplotě do druhého dne. 7) Druhý den proveďte výměnu 80% etanolu a umístěte semenáčky na 4°C, kde je ponecháte do 4. dne (čtvrtek). 8) 4. den proveďte projasnění podle následujícího protokolu: a) Opatrně odpipetujte 80% etanol a přidejte 1 ml 0,25M HCl / 20% MetOH, 15min, 53 °C2. Roztok odstranit. b) 1 ml 7% NaOH / 60% EtOH, 15 min, rt3. Roztok odstranit. c) 1 ml 40% EtOH, 10 min, rt. d) +1 ml H20 = 20% EtOH, 10 min, rt. Roztok odsát. e) 1 ml 10% EtOH, 10 min, rt. f) +1 ml 50% glycerolu = 5% EtOH / 25% glycerol, 15-30min, rt (on, 4 °C). Roztok odsát. g) 1 ml 50% glycerol. 9) Opatrně přeneste projasněné semenáčky na sklíčka a připravyte pro automatickou mikroskopii. 10) Spuštění automatického mikroskopu přes noc. 11)5. Den vyhodnocení výsledků barvení. 2 hybridizační pec 3 rt, pokojová teplota Verze: 1. 12. 2008 B7201 - Základy genomiky, cvičení 3 Schéma nejdůležitějších morfologických a anatomických částí semenáčku Arabidopsis thaliana. PRAVÉ LISTY DELOZNI LÍSTKY APIKALNI MERISTEM PRYTU KOREŇOVÉ VLÁSKY BOCNI (LATERALNI) KOŘENY KOREŇOVÁ SPICKA EPIDERMIS ^| PROTOFLOEM KORTEX CÉVNÍ PLETIVA ENDODERMS ffijj.í CENTRÁLNÍ BUŇKY KOŘENOVÉHO MER1STÉMU PERICYKL LATERÁLNi KOŘENOVÁ ČEPIČKA PROTOXVLEM ^^H KOLUMELA Verze: 1. 12. 2008 B7201 - Základy genomiky, cvičení 4 Šablona k protokolům: Analýza aktivity promotoru pomoci transkripční fůze Jméno: Datum: Úloha: Cíl: Postup a výsledky: Závěr4: 4 Do protokolu zejména uveďte: název analyzovaného promotoru, stručný popis principu metody, zda se podařilo identifikovat místa specifické aktivity daného promotoru (uveďte stručný výčet barvených pletiv) a co lze z tohoto výsledku uzavřít, příp. pro co jej dále použít. Verze: 1. 12. 2008 B7201 - Základy genomiky, cvičení 5 Určení optimální sekvence PCR primeru na základě úseku DNA z Arabidopsis thaliana pomoci programu OLIGO 6 Praktické seznámení se základními pojmy a menu na počítači Aktuální oligo. Typy primeru (forward, reverse). Volná energie. Dimer versus duplex. Interní stabilita. Vlásenky. Účinnost primem. Terminálni stabilita. Teplota tání Tm. Vložení sekvence úseku DNA z Arabidopsis thaliana do databáze. Specifikace parametrů navrhované dvojice primem, výběr optimální dvojice pro PCR amplifikaci studovaného úseku DNA. Finální výstup v tištěné podobě přiložte k protokolu. Syntéza PCR primeru na syntetizátoru Expedite 8909 Vložení sekvence primem do databáze. Výtisk Volba parametrů syntézy (ON vs. OFF, rozsah syntézy), volba vhodné kolony, vlastní syntéza. Sledování účinnosti jednotlivých kroků syntézy (výtisk histogramu přiložte k protokolu). Odštěpení produktu z kolonky amoniolýzou. Tepelná deprotekce. Vakuové sušení v koncentračním systému Speedvac. Purifikace primeru: Odsolení gelovou filtrací na molekulovém sítu Odstranění nízkomolekulárních nečistot se provádí etanolovou precipitací nebo gelovou filtrací na kolonce Sephadexu G-25. Pokud je pro některé aplikace nutné odstranit kratší nedosyntetizované řetězce (např. pro antisense hybridizace), používá se purifikace na OPC (Oligonucleotide Purification Cartridge). Nejúčinnějším, ale finančně nejnáročnějším způsobem čištění je HPLC. Metoda IB Odsolení na CENTPJ-SPIN 10 kolonce (Princeton Separations, Inc.). Vysušený vzorek primem rozpustíme v 50 |j,l deionizované vody. Krátce necháme stát, protřepeme příp. asi na minutu zahřejeme na 65 °C a nakonec krátce zcentrifugujeme. Hydratace kolonky CENTRI-SPIN 10 Sklepat suchý gel do spodní části kolonky, otevřít homí zátku a nanést 650 j_l1 deionizované vody, zavřít a asi 5 s třepat na vortexu. Poklepáním se ještě zbavit posledních bublin. Poté nejméně 30 min nechat při pokojové teplotě probíhat hydrataci Sephadexu. Otevřít horní i spodní zátku kolonky a tuto vložit do připravené mikrozkumavky bez víčka (wash-tube). Centrifugovat 2 min při 75Og (odpovídá 2700 otáčkám na centrifuze Eppendorf 5415C). Po skončení centrifugace je v mikrozkumavce voda, tj. odpad. Osušíme poslední kapky na kolonce. Ta je nyní připravena k vlastní aplikaci vzorku, která by měla proběhnout během několika minut po skončení hydratace. Vlastní odsolení vzorku Kolonku vložte do mikrozkumavky s víčkem, víčko označte číslem skupiny (sample-tube) a opatrně do centra gelu po kapkách naneste automatickou pipetou předem 50|al připraveného vzorku. Následuje centrifugace 2 min při 75Og (2700 otáčkách). Po skončení centrifugace přidejte k odsolenému primem v mikrozkumavce 950 j_l1 deionizované vody, protřepte. Ve stojánku je připravena jedna Verze: 1. 12. 2008 B7201 - Základy genomiky, cvičení 6 mikrozkumavka označená na víčku UV (pro měření výtěžku) obsahující .......|_il vody a jedna prázdná označená QC (pro chromatografickou kontrolu kvality). Do UV mikrozkumavky přidejte ...... |_il odsoleného primem na měření absorbance a do QC mikrozkumavky napipetujte 50 j_l1 odsoleného primem. Určení výtěžku. Stanovení absorbance zředěného vzorku měřením při 260 nm (spektrofotometr HELIOS). Definice jednotky OD. Výpočet výtěžku syntézy v jednotkách OD a převody do jiných jednotek. Výtisk protokolu o syntéze s doplněným výtěžkem surového a odsoleného produktu přiložte k protokolu ze cvičení. Kontrola kvality. Chromatografie na ionexovém perfúzním sorbentu Poros HQ 10 (Applied Biosystems). Stměné seznámení s výhodami perfúzní chromatografie na přístroji BioCAD 700E (Applied Biosystems). Výběr vhodné kolony a vhodné analytické metody. Manuální nástřik 20 j_l1 surového a odsoleného PCR primem. Porovnání chromatogramů. Výtisk obou chromatogramů ve zvoleném modu (Tile, Overlay) přiložte k protokolu. Úkoly Doplňte následující protokol - pouze jeden pro dvojici PROTOKOL Číslo skupiny: Jména: Datum: Úloha: SYNTÉZA A PURIFIKACE OLIGONUKLEOTIDŮ Cíl: Seznámit se se současnými možnostmi při automatické syntéze oligonukleotidů, s dostupnými modifikacemi a aplikacemi. Porozumět základním zásadám pro navrhování PCR primem. Pochopit základní princip syntézy oligonukleotidů a umět se zorientovat v jednotkách, ve kterých se vyjadřuje výtěžek. Umět vysvětlit základní rozdíl v čistotě produktu po jednotlivých typech purifikací. Návrh sekvence primem Přiložte výstup ze software OLIGO 6, primery označte číslem skupiny, stmčně zhodnoťte kvalitu nalezených primem. Syntéza Přiložte histogram ze syntézy a protokol ze syntézy s doplněným výtěžkem vyjádřeným v jednotkách OD, |LLg a v jednotce molární koncentrace. Odsolení Přiložte výstup z chromatografu obsahující chromatogramy surového a odsoleného vzorku. Jednou větou zhodnoťte, zda je pozorovatelný rozdíl a vysvětlete. Verze: 1. 12. 2008 B7201 - Základy genomiky, cvičení 7 Rozšiřující literatura dostupná v Centrální laboratoři Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1987. Aktuální verze „OLIGO", Primer Analysis Software. User Manual. Version 6, MBI, 2000. PCR Primer, A Laboratory Manual. Carl W. Dieffenbach, Gabriela S. Dveksler, Cold Spring Harbor Laboratory Press 1995. DEN 2 IZOLACE ROSTLINNÉ DNA, PCR, PRÁCE S DATABÁZEMI MOLEKULÁRNĚ-BIOLOGICKÝCH INFORMACÍ Úvod Jednou z metod studia genomu je amplifikace krátkých úseků DNA pomocí PCR. V laboratoři si osvojíte rychlou metodu izolace DNA z rostlinného materiálu a založíte několik PCR reakcí. Amplifikovat budeme úsek DNA pro použití jako sondu v pozdější hybridizaci a oblast inzerce cizí DNA (transpozonu En-1, dSpm a T-DNA) v genech AHP4, ARR4 a ARR21. v Časový harmonogram 8:30 Úvod k praktické části (Jan Hejátko) 8:45 ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ TRANSKRIPČNÍ FŮZE 6. Výměna etanolu, uložení vzorků na 4 °C 9:00 IZOLACE DNA (Jan Hejátko) 10:00 DATABÁZE (Jan Hej átko) 12:00 OBĚD 13:00 ZALOŽENÍ PCR (Jan Hejátko) 14:00 DATABÁZE-dokončení (Jan Hejátko) Přehled Úvod k praktické části • Úvod do metodologie praktika Verze: 1. 12. 2008 B7201 - Základy genomiky, cvičení o obecné zásady práce s DNA a sterilními roztoky o schéma experimentu o navržení postupu pro identifikaci inzerčního mutanta a zjištění jestli se jedná o homo-nebo heterozygotní stav, vlastní provedení Praktická část 1. Izolace DNA 2. Založení PCR Metoda 2A Rychlá izolace DNA pro PCR 1. Homogenizovat jeden střední list vychlazenou skleněnou tyčinkou v l,5ml zkumavce (eppendorfka) ve stojánku. 2. Přidat 400 [ú extrakčního pufru, vortexovat 5 s a nechat stát při laboratorní teplotě 60 min. 3. Centrifugovat při 14000 otáčkách 30 min, 4°C. 4. Přenést 300 ul supematantu do nové l,5ml zkumavky a přidat 300 [ú izopropanolu, 4-6 krát překlopit. Nechat stát 10 min při laboratorní teplotě. 5. Centrifugovat 20 min, 4°C. Odstranit supernatant, DNA vysrážená izopropanolem bude v peletu. 6. Přidat 500 ul 70% etanolu. Centrifugovat při 14000 otáčkách 2 min. Odstranit etanol. Nechat vysušit (SpeeďVac, cca 10-15 min). 7. Pelet rozpustit ve 100 j_l1 sterilní ddH20. Genomovou DNA uchovávat na ledu nebo v lednici. Extrakční pufr Tris/HCl (200mM, pH7.5) NaCl (250mM) EDTA (25mM) SDS (0.5%) Metoda 2B Založení PCR Do 0.5 ml zkumavek pro PCR napipetovat postupně vodu, pufr, dNTP, templát, primery a Taq polymerázu podle schématu: PCR směs: lOxpufr dNTP priml prim2 Taq pol. templ. DNA H20 celk. 50 ul 5ul 4ul lul lul 2ul 5ul 32 ul primery AHP4 spec: Sim612, Sim 799 - 212 bp primery ARR21 spec: 16kon, 16new- 340 bp primery ARR4 spec: ARR4N, ARR4S - 137 bp primer transpozon 8130, Sim 799 - 250 bp 8130, 16new- 390 bp dll,ARR4N- 195 bp Verze: 1. 12. 2008 B7201 - Základy genomiky, cvičení 9 Navrhněte vhodnou kombinaci primem a to tak, aby jste byli pomocí výsledků PCR reakce schopni identifikovat inerčního mutanta ve vašem genu a zjistit, zda se jedná o jedince homozygotního nebo heterozygotního pro danou inzerční alelu. Využijte schéma na straně 8: Kombinace primem pro jednotlivé typy templářů (viz také schéma na následující straně): primery templátová DNA AHP4: la .................... ...................... 2a .................... ...................... 3a .................... ...................... 4a .................... ...................... ARR21: lb 2b 3b 4b ARR4: lc 2c 3c 4c Na základě přiložených výsledků analýzy použitých primem pomocí programu Oligo navrhněte vhodné podmínky PCR pro dané reakce: Verze: 1. 12. 2008 B7201 - Základy genomiky, cvičení 10 ÁRR4 dllv dSpm AHP4 ATO ARR21 1 DllOW Úkoly (příklad): 1. Vyhledejte jeden bakteriální a jeden rostlinný gen Glu-6-P izomerázy v databáze Genbank 2. Vyhledejte geny cheY a cheA u E. coli 3. Určete nejbližší homolog cheY(E. Coli) w Arabidopsis pomocí algoritmů BLAST a FASTA. 4. Najděte tři různé regulátory odezvy nebo histidin kinázy u Arabidopsis. 5. Určete u libovolného genu v úkolu 4 polohu v genomu Arabidopsis (chromosom, polohu v publikované sekvenci daného chromosomu). 6. Vyberte si jeden gen z úkolu 4 a určete oblast 1000 baží v oblasti promotoru genu. Ukončete sekvenci na ATG. Analyzujte na přítomnost vazebních míst transkripčních faktorů pomocí hledání v databázi TRANSFAC. 7. Srovnejte libovolné sekvence zArabidopsis s homologií větší než 30% a menší než 100% pomocí algoritmu CLUSTALW. 8. Vyhledejte nejméně jednu EST sekvenci Glu-6-P izomerázy (hledání homologie nebo podle klíčového slova). Verze: 1. 12. 2008 B7201 - Základy genomiky, cvičení 11 Šablona k protokolům: Izolace DNA a PCR Jméno: Datum: Úloha: Cíl: Postup a výsledky: Závěr5: 5 Uveďte zejména, zda jste identifikovali inzerčního mutanta a zda se jedná o homozygota nebo o heterozygota pro danou inzerční alelu a proč. Verze: 1. 12. 2008 B7201 - Základy genomiky, cvičení 12 DEN 3 IDENTIFIKACE PCR PRODUKTU NA GELU, ZNAČENÍ SONDY PRO HYBRIDIZACÍ, PŘENOS DNA Z GELU NA MEMBRÁNU Úvod Další způsob identifikace genů je hybridizace se značenou sondou. Ta je připravena z DNA známé sekvence a označena tak, aby byla detekovatelná po navázání na homologní případně heterologní sekvenci DNA, která je imobilizovaná na membráně. Ta se přenese na membránu z gelu spontánním kapilárním sáním. Pokud se přenáší na membránu genomová DNA, mluvíme o metodě Southern blotting. Ve cvičení připravíme agarózový gel umožňující elektroforetické rozdělení PCR produktů podle velikosti. Z gelu přeneseme DNA na nylonovou membránu v alkalickém prostředí. Přítomnost specifické DNA na membráně prokážeme hybridizací se sondou značenou alkalickou fostatázou zprostředkující chemiluminiscenční signál. Časový harmonogram 8:00 PŘÍPRAVA AGARÓZOVÉHO GELU, NAPIPETOVÁNÍ VZORKŮ, ELEKTROFORÉZA 9:00 STRUČNÝ ÚVOD K IDENTIFIKACI FRAGMENTŮ HYBRIDIZACÍ SE ZNAČENOU SONDOU (Alena Kuderová, Markéta Pernisová) 10:00 IDENTIFIKACE PCR PRODUKTŮ NA AGARÓZOVÉM GELU (Alena Kuderová, Markéta Pernisová) 11:00 KAPILÁRNÍ TRANSFER (Alena Kuderová, Markéta Pernisová) 12:00 OBĚD 13:30 ZNAČENÍ SOND A HYBRIDIZACE (Alena Kuderová, Markéta Pernisová) Přehled metod 1. Elektroforéza DNA v agarózovém gelu 2. Detekce na UV transiluminátoru 3. Kapilární transfer (Southern blotting) 4. Přečištění PCR produktu 5. Určování koncentrace DNA 6. Značení sondy 7. Hybridizace Verze: 1. 12. 2008 B7201 - Základy genomiky, cvičení 13 Metoda 3A Příprava agarózového gelu, elektroforéza PCR produktů a jejich detekce. 1. Ve 250 ml láhvi svařit 100 ml lx TBE pufiru a 1,5 g agarózy. Po rozpuštění agarózy přidat 2 jxl etidium bromidu, který bude sloužit k vizualizaci DNA. 2. Připravit formu pro gel, vsadit hřeben a nalít do formy vrstvu tekuté agarózy 5-8 mm. Nechat ztuhnout. 3. Formu s gelem vložit do elektroforézové vany, zalít pufirem a vyjmout hřeben. 4. Napipetovat délkový a hmotnostní standard a vzorky: • délkový a hmotnostní standard (NEB): 10|al (0,5 |ag) • vzorek: 10 j_l1 PCR (zbytek ponechat pro přípravu sondy) + 1 |_il nanášecího pufru 5. Spustit elektroforézu při 80 V po dobu 60 min (aby bromfenolová modř, která putuje s nejkratšími fragmenty neopustila gel). 6. Pozorovat proužky DNA v procházejícím UV světle a výsledek elektroforézy dokumentovat; bude později porovnáván se signály na hybridizační membráně. Tento gel bude použit pro Southern blotting. Délkový a hmotnostní standard: 100 bp DNA ladder (0,5 |ag) Basa Pairs DMA Mass (na) - 1,517 4 5 - 1,20D as ^1,000 BB- - 900 27 - aoo 24 - 700 2" - 500 15 - 500/517 ■37 - 400 ;■; :?<: 2? 2DC 25 1DC 4-:. Metoda 3B Kapilární přenos v alkalickém prostředí Po fotodokumentaci odstranit část gelu nad starty a pravý horní roh gelu. Dále změřit výšku a šířku gelu. Gel umístit do vaničky s destilovanou vodou a krátce opláchnout. Vylít destilovanou vodu, přidat až 10 objemů přenosového roztoku (1,5M NaCl/0,5M NaOH), Verze: 1. 12. 2008 B7201 - Základy genomiky, cvičení 14 umístit na kývací platformu a míchat 30 až 40 min. 3. Během této doby sestavit aparaturu pro přenos DNA: a. Přes čistou vaničku položit skleněnou desku. b. Ustřihnout obdélník filtračního papíru Whatman 3MM takových rozměrů, aby po přiložení přes skleněnou desku nepřesáhl šířku vaničky a zasahoval oběma užšími konci až na dno vaničky. Toto je první vrstva knotu, který bude sát roztok. c. Ustřihnout 3 obdélníky filtračního papíru Whatman 3MM takové velikosti, aby přesahovaly výšku i šířku gelu asi o 1 cm na každé straně a další 3 obdélníky velikosti gelu. d. Nastříhat jednotlivé vrstvy buničiny o rozměrech gelu. Mělo by jich být tolik, aby po zatížení byla jejich výška 7-8 cm. e. Ustřihnout nylonovou membránu Hybond N+ velikosti gelu. f. Naplnit vaničku přenosovým roztokem a část ponechat v petriho misce. g. Smočit nejdelší filtrační papír Whatman 3MM a umístit na skleněnou desku. Pomocí skleněné pipety nebo tyčinky se zbavíme všech případných bublin mezi sklem a papírem. h. Smočit 3 větší filtrační papíry Whatman 3MM a postupně vrstvit do středu aparatury tak, aby nevznikaly vzduchové bubliny, i. Vyjmout gel z přenosového roztoku a přiložit opatrně vrchní stranou do středu vrchního filtračního papíru; odstranit všechny vzduchové bubliny, j. Opatrně umístit nylonovou membránu na gel (od středu ke krajům). Okamžitě vzniká těsný kontakt s gelem. Při chybné manipulaci se nesnažit o opětovné umístění membrány na gel- v takovém případě použít novou membránu, k. Smočit postupně poslední tři filtrační papíry Whatman 3MM a vrstvit je na membránu. Odstranit případné vzduchové bubliny. 1. Nakonec přiložit vrstvu buničiny, zatížit suchou petriho miskou, kterou dále zatížíme odměrnou baňkou naplněnou asi 200 ml vody. Nádobu zabezpečíme úchytkou na stojanu. 4. Zkontrolovat kontakt jednotlivých vrstev a pomocí proužků parafilmu umístěných těsně kolem gelu zamezit nežádoucímu kontaktu vrstev. Tak se veškerý přenosový roztok může do horních vrstev dostávat pouze přes gel a nebude „obtékat". V opačném případě by se účinnost a stejnoměrnost přenosu snižovala. 5. Přenos nechat probíhat 4 hodiny, potom aparaturu rozebrat, membránu opláchnout v roztoku 2 x SSC a nechat uschnout mezi dvěmi filtračními papíry. V alkalickém prostředí se mezi nylonovou membránou a DNA vytvořily kovalentní vazby, a není proto nutné DNA imobilizovat dalšími postupy. Metoda 3C Izolace PCR produktu z agarózového gelu pomocí komerční soupravy Qiagen 1. Na nový agarózový gel nanést 35 jal PCR směsi + 3,5jll1 nanášecího pufru. 2. Po elektroforéze z agarózového gelu vyříznout daný proužek, aby bloček agarózy byl co nejmenší. 3. Určit jeho hmotnost. 4. Přidat 3x objem pufru QG (tj. 100 mg gelu - lOOjal QG). 5. Zahřát na teplotu 50°C po dobu 10 min nebo dokud se agaróza nerozpustí. Průběžně 2-3x promíchat. 6. Přidat lx objem (gelu) izopropanolu, promíchat a vše dát do kolonky. 7. Centrifugovat při 14000 otáčkách 3Os, odstranit protečený roztok. 8. Do kolonky přidat 750jj.1 pufru PE a centrifugovat při 14000 otáčkách 30s, odstranit protečený roztok. Centrifugovat ještě jednou bez pufru. Kolonku umístit do čisté zkumavky. Verze: 1. 12. 2008 B7201 - Základy genomiky, cvičení 15 9. Na střed kolonky napipetovat 30|al sterilní ddH20, nechat stát 5 min při laboratorní teplotě a centrifugovat 1 min. Metoda 3D Měření koncentrace DNA spektrofotometricky 1. V čisté zkumavce naředit DNA lOOx v objemu 200jal. 2. Do kyvety napipetovat 200(al sterilní ddH20, vynulovat absorbanci. 3. Odstranit vodu z kyvety, napipetovat naředěnou DNA a změřit absorbanci. 4. Vypočítat koncentraci podle vzorce: OD26o =1,0 => konc. DNA = 50ng/|al. Metoda 3E Příprava značené sondy 1. Naředit DNA na koncentraci 10 ng/ul. 2. Umístit 10 ul této DNA do zkumavky a denaturovat 5 min ve vroucí vodě. 3. Okamžitě umístit DNA na led a 5 min chladit (po schlazení - asi 2 až 3 min. - rychle stočit, aby se zkondenzovaná kapalina dostala na dno) 4. Přidat: 10 |j,l reakčního pufru 2 |j,l značícího činidla 10 |j,l pracovní koncentrace „cross-linkeru" (činidla, které zprostředkovává kovalentní vazbu enzymu na DNA). 5. Vše promíchat, stočit a inkubovat 30 min/ 37°C. Sonda se může použít ihned nebo může být skladována na ledu 2 hodiny. Metoda 3F Hybridizace 1. Předehřát požadovaný objem hybridizačního roztoku na požadovanou teplotu (55°C); objem pufru: 0,25 ml pufru /cm2 membrány. 2. Umístit membránu do hybridizačního válce s pufrem a prehybridizovat nejméně 30 min/55°C. 3. Přidat značenou sondu a hybridizovat přes noc. Literatura Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1987, 1st Volume, Preparation and analysis of DNA. Verze: 1. 12. 2008 B7201 - Základy genomiky, cvičení 16 přiložit a popsat zdokumentované výsledky, zdůvodnit případné nejasnosti. Kapilární přenos DNA a hybridizace se značenou sondou Postup a výsledky Závěr: Úkoly Vypracování protokolu: Šablona k protokolům: Jméno: Datum: Úloha: Cíl: Verze: 1. 12. 2008 B7201 - Základy genomiky, cvičení 17 DEN 4 FRAGMENTAČNÍ ANALÝZA Úvod Cílem práce je určit velikost jednotlivých fragmentu DNA ze tří různých rostlin Arabidopsis thaliana získaných PCR reakcemi se dvěma páry primem a na základě této kvantifikace rozhodnout, zda se jedná o divoký typ, homozygotní či heterozygotní rostlinu. Studenti provedou PCR reakce s fluorescenčně značenými primery, z jejich produktů připraví vzorky pro fragmentační analýzu na automatickém genetickém analyzátom ABI PRISM 310, kvantifikují fragmenty a interpretují výsledky analýzy. V další části práce se studenti seznámí s možnostmi vícebarevného značení fragmentů při studiu mikrosatelitů. Časový harmonogram 9:00 PROMÝVÁNÍ MEMBRÁN PO HYBRIDIZACI (Alena Kuderová, Markéta Pemisová) 10:15 FRAGMENTAČNÍ ANALÝZA (Eva Paděrová) 12:00 OBĚD 13:30 FRAGMENTAČNÍ ANALÝZA (Eva Paděrová) DETEKCE HYBRIDIZACE (Alena Kuderová, Markéta Pemisová) 15:00 ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ TRANSKRIPČNÍ FŮZE (Jan Hejátko) 5. Projasňování vzorků 6. Příprava preparátů 7. Automatická mikroskopie Přehled Automatický genetický analyzátor ABI PRISM 310 je založen na principu kapilární elektroforézy fluorescenčně značených DNA fragmentů. Má využití jednak pro sekvenování DNA, jednak pro fragmentační analýzu. Jednotlivé DNA fragmenty jsou elektroforézou v kapiláře rozděleny a postupně detekovány laserovým detektorem. Při fragmentační analýze připravíme fragmenty DNA PCR reakcí s jedním nebo několika páry primem, kdy jeden primer z každého pám je fluorescenčně značený. V průběhu jediného běhu pak můžeme současně analyzovat několik různých fragmentů za předpokladu, že se navzájem liší svou délkou nebo jsou označeny různými fluorescenčními barvami. Spolu s každým vzorkem běží interní délkový standard, který umožní přesnou kvantifikaci jednotlivých fragmentů. Je možné využít až pět různých fluorescenčních značek, přičemž pátá je pak vyhrazena pro délkový standard. Verze: 1. 12. 2008 B7201 - Základy genomiky, cvičení 18 Metoda 4A Příprava fluorescenčně značených DNA fragmentů Pro tuto úlohu využíváme genomovou DNA z rostlin Arabidopsis thaliana izolovanou v předchozích dnech. Pro každou z nich připravíme dvě PCR reakce . Objemy pipetujeme do PCR zkumavek podle následujícího postupu: 5 ul dNTP mix 5 ul PCR buffer 2 ul Taq polymerasa 37 ul ddH20 1 ul DNA 2,0 ul každý z primerů Příklad dvojice primerů pro mutant AHP4 1. PCR zkumavka 2. PCR zkumavka 3. PCR zkumavka 4. PCR zkumavka Mutai atAHP4 * Sim 799; Sim-612 Mutai atAHP4 * Sim 799; 8130 WT * Sim 799; Sim-612 WT * Sim 799; 8130 Příklad dvojice primerů pro mutant ARR21 1. PCR zkumavka 2. PCR zkumavka 3. PCR zkumavka 4. PCR zkumavka Mutant ARR21 Mutant ARR21 WT WT :16new; 16kon :16new; 1830 :16new; 16kon :16new;8130 Příklad dvojice primerů pro mutant ARR4 1. PCR zkumavka: Mutant ARR4 2. PCR zkumavka: Mutant ARR4 3. PCR zkumavka: WT 4. PCR zkumavka WT >=ARR4N ARR4S2 >=ARR4Ndll >=ARR4N ARR4S2 >=ARR4Ndll Obsah protřepeme na Vortexu a stočíme na centrifuze. PCR cykler nastavíme takto: HOLD CYCLE HOLD HOLD 2 min 20 sec 30 sec 60 sec 8 min hold 94 C 94 C 57 C 70 C 72 C 4C Verze: 1. 12 2008 B7201 - Základy genomiky, cvičení 19 Příprava vzorků pro genetický analyzátor 1. Do vialky určené pro analyzátor pipetujeme pro každého testovaného jedince: 0,5 ul PCR produktu u Arabidopsis 1.0 ul délkového standardu TAMRA 500 12 ul form amidu 2. Protřepeme na Vortexu. 3. Denaturujeme 3 min při 95 C. 4. Rychle zchladíme na ledu. Fragmentační analýza na ABI PRISM 310 Analýzu provádíme na křemíkové kapiláře dlouhé 41 cm (efektivní délka 30 cm) za použití polymeru POP4 na bázi polyakrylamidu. Vzorky umístíme do automatického dávkovače a vyplníme seznam vzorků, pořadí nástřiků a parametry analýzy podle pokynů vyučujícího. Píky jednotlivých fragmentů kvantifikujeme vzhledem k předem vyhodnocenému délkovému standardu. Interpretace dat fragmentační analýzy A rabi dopsis Porovnáme velikosti jednotlivých fragmentů ze tří jedinců. Na jejich základě určíme, kdy se jedná o heterozygotní či homozygotní rostlinu nebo divoký typ. S3. 5U Ut 11Ö »14 -*o *1G g£ "■ -1,__ ca !—■ i | í i í 8 1 ''._^-™JI-_ ™-w t J ..... L 1 JUL. Verze: 1. 12. 2008 B7201 - Základy genomiky, cvičení 20 Metoda 4B Posthybridizační stringentní promývání 1. Předehřát primární promývací pufr na 60°C. Použitý objem: 2-5 ml/ cm membrány. 2. Opatrně přenést membránu do válce s tímto roztokem a promývat 4x5 min při 60°C. 3. Promývat 2x5 min druhým promývacím roztokem při laboratorní teplotě. 4. Membránu vložit do misky s druhým promývacím roztokem a nechat stát 10-15 min. Chemifluorescenční detekce signálu za použití ECF substrátu 1. Membránu umístit na čistý neabsorpční povrch a napipetovat rovnoměrně po celém jejím povrchu ECF substrát (25 jlxI/ cm2 membrány); inkubovat 1 min. 2. Přiložit vrchní část detekční folie, odsát přebytek substrátu a zatavit. 3. Inkubovat ve tmě při laboratorní teplotě. První detekci provést přibližně po 2 hodinách. Detekce chemifluorescenčního signálu 1. 0,5 h před detekcí zapnout STORM. 2. Na detekční plotnu přístoje kápnout trochu EtOH. Na toto místo přiložit folii s membránou (lépe přilne k povrchu a eliminují se bubliny). 3. Skenovat pro chemifluorescenci při rozlišení 100 mikronů. Verze: 1. 12. 2008 B7201 - Základy genomiky, cvičení 21 DEN 5 8:00 VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ FRAGMENTAČNÍ ANALÝZY (Eva Paděrová) 9:00 ANALÝZA GENOVÉ EXPRESE POMOCÍ TRANSKRIPČNÍ FŮZE (Jan Hejátko) 8. Vyhodnocení výsledků mikroskopie Šablona k protokolům: Fragmentační analýza Jméno: Datum: Úloha: Cíl: Postup a výsledky (s přiloženými spektry): Závěr:6 6 Určit, zda jde o homozygota či heterozygota a proč (zdůvodnit). Verze: 1. 12. 2008