2 1 Barevné principy absorpce a fluorescence Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii Ctirad Hofr 27.9.2007 2 2 Světlo je elektromagnetické vlnění Škládá se z elektrické složky a magnetické složky, které kmitají ve fázi v na sebe kolmých rovinách Švětlo je charakterizováno frekvencí f a vlnovou délkou ˇFrekvence f udává kolikrát za sekundu vlnění kmitne, udává se v Hz = s-1 ˇVlnová délka udává délku, kterou za jeden kmit světlo urazí, udává se v nanometrech nm = 10-9 m ˇFrekvence f a vlnová délka jsou spojeny vztahem c = f kde c je rychlost světla -vlnění (c=299 792 458 m s-1 ve vakuu) Ěnergie E = h f, kde h je Planckova konstanta (6.626 10-34 J s) 2 3 Animace elektromagnetického vlnění http://www.edumedia-sciences.com/a185_l2-transverse-electromagnetic-wave.html Elektromagnetická vlna z xy c = f c je konstanta, pak jestliže se zvýší vlnová délka, musí se snížit frekvence, aby byl součin konstantní. Vlnová délka je nepřímo úměrná frekvenci f E = h f Čím je větší frekvence, tím je větší energie záření. Čím je vetší vlnová délka , tím je menší energie záření. B E 2 4 Viditelné spektrum Z celého spektra záření je pouze malá část viditelná. Viditelné spektrum je ohraničeno vlnovými délkami 400 nm a 700 nm. http://science.hq.nasa.gov/kids/imagers/ems/visible.html 400 nm 7.5 10-14Hz 700 nm 4.3 10-14Hz 2 5 Intenzita Intenzita ­ počet fotonů procházejících v daném směru jednotkovou plochou za jednotku času S 2 6 Absorpce * Látka pohlcuje světlo * Pro absorpci monochromatického světla * Lambert-Beerův zákon: Absorbance je přímo úměrná koncentraci a tloušťce vrstvy roztoku lc II = 100 I I lcA 0 10log== =molární extinční koeficient látky, c-koncentrace, l-délka optické dráhy 2 7 Luminiscence * Emise světla z nějaké látky; nastává z elektronových excitovaných stavů Luminiscence se dělí na: 1.fluorescenci 2.fosforescenci Podle původu dělíme luminiscenci na 1.fotoluminiscenci 2. chemiluminiscenci 2 8 Fluorescence * Emise z excitovaných singletových stavů * Prakticky: fluorescenci pozorujeme během buzení a po jeho vypnutí rychle mizí * Doba dohasínání (Lifetime) je průměrný čas, který uplyne od exitace po emisi ­ je řádově 1 ­ 10 nanosekund * pozn. : světlo urazí za 1 ns 30 cm 2 9 Fosforescence * Emise z excitovaných (zakázaných) tripletových stavů * Prakticky: fosforescence má mnohem delší dobu dohasínání než fluorescence Doba dohasínání řádově milisekundy až sekundy pozn. : světlo urazí za tu dobu 300 až 300 000 km 2 10 Frank-Condonův princip o ,,lenosti jader" při absorpci Absorpce fotonu elektronem (excitace molekuly) je velmi rychlý proces v řádu femtosekund (10-15s). Protože atomové jádro je mnohem těžší než elektron, během absorpce fotonu se nepohybuje. Po absorbci fotonu - excitaci se celá molekula nachází v nestabilním stavu (,,je horká") a vibruje, aby se zbavila energie (a ,,ochladila se"). 2 11 Absorpce a emise energie molekulou Energie 0 1 2 0 1 2 Vzdálenost Základní stav Excitovaný stav 2 12 Zářivé a nezářivé přechody mezi elektronově vibračními stavy molekuly absorpce fluorescence fosforescence 10-15 s 10-8 s 10-3 -100 s absorpce fluorescence fosforescence T1 S2 vnitřní konverze mezisystémová konverzeS1 vibrační relaxace EnergieE=hf 2 13 Barevný animovaný úvod do principu fluorescence http://probes.invitrogen.com/resources/educ ation/tutorials/1Introduction/player.html 2 14 Stokesův zákon Vlnová délka emitovaného světla je větší nebo rovna vlnové délce excitačního světla em ex To je dáno tím, že po absorpci záření často dochází k částečné ztrátě energie (tepla) při přechodu z vyšších excitovaných elektronových stavů do metastabilního nejnižšího excitovaného stavu. Ex 520 nm Em 580 nm 2 15 Stokesův posun Emise má vždy menší energii (větší vlnovou délku) než je energie absorbovaná (menší ). Rozdíl mezi maximem absorpčního a maximem fluorescenčního emisního spektra je specifická charakteristika daného fluoroforu. 2 16 Experiment G. G. Stokese Slunce Modré sklo okna v kostele Propouští světlo s < 400 nm Excitační filtr Roztok chininu Sklenice vína Propouští světlo s > 400 nm Emisní filtr G.G. Stokes 1852, Cambridge 2 17 Po záměně filtrů ­ fluorescence mizí Při záměně filtrů , tj. jestliže dáme sklenici vína do dráhy slunečních paprsků, procházející světlo již nemůže roztok chininu excitovat. 2 18 Typické fluorofory Fluorofory nebo fluoreoscenční barviva jsou molekuly, které fluoreskují. Fluorescenci vykazují zejména aromatické sloučeniny (polyaromatické uhlovodíky nebo heterocykly). Typickými flourofory jsou například: čhinin (tonik) ˇfluorescein, rhodamin B (nemrznoucí směsi, fluorescenční značení) ˇPOPOP (scintilátory) ˇakridinová oranž (DNA) ˇumbeliferon (ELISA) ˇantracén, perylén (znečištění životního prostředí oleji) 2 19J.R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Third Edition,Springer, 2006 2 20 Kvantový výtěžek Kvantový výtěžek Q je poměr počtu emitovaných a absorbovaných fotonů. Udává účinnost s jakou budící fotony vyvolávají fluorescenci. Kvantový výtěžek může být maximálně 1. Ve skutečnosti je nižší díky nezářivým přechodům molekul z excitovaného stavu. Největší kvantové výtěžky mají rodaminové flourofory (~1) a fluorescein (0.95) http://www.iss.com/resources/yield.html Charakteristické je snižování kvantového výtěžku s teplotouteplotní zhášení luminiscence 2 21 Excitační spektrum Závislost intenzity fluorescence na excitační vlnové délce při konstantní vlnové délce emitovaného záření Em= konst.Ex scan 2 22 Emisní spektrum Závislost intenzity fluorescence na vlnové délce při konstantní excitační vlnové délce Ex= konst.Em scan 2 23 Neměnnost emisního spektra Emisní spektra jsou nezávislá na vlnové délce excitace. Tento jev je důsledkem toho, že doba trvání excitovaného stavu a kvantový výtěžek složitých molekul v roztoku nezávisí na vlnové délce budícího záření 2 24 Barevný animovaný úvod do fluorescenční spektroskopie http://probes.invitrogen.com/resources/educ ation/tutorials/2Spectra/player.html 2 25 Zákon zrcadlové symetrie mezi absorpčním a emisním spektrem Struktura vibračních hladin u základního i excitovaného stavu je stejná, proto absorpce i emise z odpovídajících si vibračních hladin může nastat se stejnou pravděpodobností. To má za následek zrcadlovou symetrii absorpčního spektra a emisního fluorescenčního spektra. Prakticky: při velmi malé koncentraci vzorku můžeme z flourescenčního emisniho spektra zjistit jak vypadá absorpční spektrum, aniž by se použilo o několik řádů větší množství vzorku 2 26 Zrcadlová symetrie absorpčního a excitačního spektra Energie 0 2 0 2 0 1 2 0 1 2 Vzdálenost Abs Emis. 0 2 0 10 1 0 2 0 0 Vlnová délka Základ. stav Excit. stav 2 27 Flourescenční excitační a emisní spektrum reálného roztoku 250 300 350 400 450 500 550 600 650 -200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 Excitation Emission FluorescenceIntensity Quinine Solution