3 1 Přístrojové vybavení pro detekci absorpce a fluorescence Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii Ctirad Hofr 4.10.2007 3 2 Opakování barevných principů fluorescence http://probes.invitrogen.com/resources/educ ation/tutorials/1Introduction/player.html 3 3 Absorpce * Látka pohlcuje světlo * Pro absorpci monochromatického světla * Lambert-Beerův zákon: Absorbance je přímo úměrná koncentraci a tloušťce vrstvy roztoku lc II = 100 I I lcA 0 10log== =molární extinční koeficient látky, c-koncentrace, l-délka optické dráhy 3 4 SpektroFOTOmetr * Přístroj pro měření absorpce světla vzorkem Absorbance je měřena při různých vlnových délkách Výsledkem je absorbční spektrum látky zdroj štěrbina výběr vlnové délky vzorek detektor 3 5 Zdroje záření a jejich použití * Wolframová žárovka (měření absorpce ve viditelném spektru) * Deuteriová lampa (měření absorpce v UV spektru) * Xenonová výbojka (zdroj pro časově ustálenou fluorescenci) Pulzní zdroje pro časově proměnnou fluorescenci: * Laser * LD a LED diody 3 6 Wolframová žárovka - viditelné spektrum Skleněná baňka naplněná inertním plynem. Uvnitř je wolframové vlákno, které je zahříváno stejnosměrným proudem. Produkuje velké množstvví tepla. Pouze 5-10 % energie se uvolňuje ve formě světla. 3 7 Deuteriová lampa * Nízkotlaký zdroj vhodný zejména pro UV oblast záření (160-400 nm) 3 8 Xenonová výbojka 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09 250 300 350 400 450 500 550 600 wavelength, nm current,A Xenon Arc Lamp (XB0), relativně hladké spektrum 220nm ­ 1000nm - + Poskytnuto HORIBA Jobin Yvon 3 9 LASER Princip * Většina molekul látky musí být v excitovaném stavu * Po absorbci světla dojde ke stimulaci molekuly a ta vyzáří dva fotony * Fotony následně způsobí emisi dvojnásobného množství fotonů * Všechny fotony mají stejnou energii,i vlnovou délku a emitované světlo má stejnou barvu ­ je monochromatické a je také koherentní * Látce je neustále dodávána energie, aby byly molekuly neustále excitovány * Fotony se odrážejí uvnitř prostoru mezi dvěma zrcadly * Fotony v pulzech procházejí částečně propustným zrcadlem * Vzdálenost pulzů je dána velikostí prostoru mezi zrcadly a rychlostí cyklu * Spektrum je čarové - pouze jedna vlnová délka zrcadlo zrcadlo (částečně propustné) pulsy z anglického Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation, tj. 'zesilování světla pomocí stimulované emise záření' http://www.edumedia-sciences.com/a392_l2-laser.html 3 10 LD - Laser Diode Thermoelectric cooler Laser diode housing Collimating lens assembly Anamorphic Prism pair Beam Collimation & Temperature Stabilization Poskytnuto HORIBA Jobin Yvon 3 11 LED Light Emiting Diode * nízký příkon * vysoká účinnost * úzký spektrální rozsah 3 12 Monochromátor Využívá rozptylu světla a vybírá ze spektra vlnovou délku nebo jejich rozsah Normála plochy mřížky Normálal žlábku (vrypu) Dopadající světlo Kužel rozptýleného světla šířka žlábku ,,Blaze" úhel úhel odrazu Rozptýlené světlo štěrbina Poskytnuto HORIBA Jobin Yvonhttp://www.shsu.edu/~chm_tgc/sounds/Czechdir/Grating%20Czech.swf 3 13 Fotoelektrický jev - - - - - - - - hf = W+ Ek W ­ energie potřebná k vyražení elektronu z látky Ek -Kinetická energie volného elektronu po vyražení Nobelova cena A. Einstein, 1921 3 14 Detektor - fotonásobič Light Detectors: Photomultiplier Tube (R928 Side-on) Boční okno 24 mm2 Fotokatoda Fokusační elektroda Násobiče elektronů (dynody) foton fotoelektron Anode Vakuum 10-4 Pa Poskytnuto HORIBA Jobin Yvon 3 15 Animované schéma spektroFOTOmetru http://www.shsu.edu/%7Echm_tgc/sounds/DB.mov Wolframová žárovka(Vis)/ deuteriová lampa (UV) štěrbina mřížkový monochromátor Kyveta z UV/Vis propustného skla Fotonásobič 3 16 Kapesní spektrofotometr http://www.cranedigital.com/html/works/anim ation/hach_assm.html 3 17 Geometrie při měření absorbance Kyveta shora Dopadající světlo Procházející světlo 3 18 Použitelný rozsah pro měření absorbance Nejpřesnější oblast: tzn.na hodnoty se můžeme nejvíce spolehnout při ABS = 0.3 - 0.7 Rozsah s linární odezvou: tj. že platí ABS = cl ABS = 0.0 ­ 1.0 3 19 Přístroje pro měření fluorescence * Přístroje založené na měření fluorescence lze rozdělit do čtyř základních typů: * 1. spektrofluorimetry ­ měří střední signál celého vzorku umístěného obvykle v kyvetě nebo v jamce mikrodestičky * 2. fluorescenční skenery (včetně čteček mikrodestiček) ­ měří fluorescenci dvojrozměrných makroskopických objektů (elektroforetické gely, bloty, chromatogramy) * 3. fluorescenční mikroskopy ­ umožňují pozorovat fluorescenci dvoj- nebo trojrozměrných mikroskopických objektů * 4. průtokové cytometry ­ měří fluorescenci velkého množství jednotlivých buněk a umožňují identifikaci a separaci jejich subpopulací * Existují však i další přístroje, které jako detekci používají fluorescenci. 3 20 Detektor ­ fotonásobič Xenonová lampa Excitační monochromátor 0.00E+00 2.00E+05 4.00E+05 6.00E+05 8.00E+05 1.00E+06 1.20E+06 300 350 400 450 500 550 600 650 wavelength, nm countss-1 Emisní monochromátor SpektroFLUOROmetr Poskytnuto HORIBA Jobin Yvon 3 21 Filtry Výhody ve srovnání s monochromátorem: Levné, kompaktní, vysoce účinné, vysoce propustné Nevýhody: nejsou nastavitelné, často se specifickými požadavky, přístroj jich pojme limitované množství (karusel), mají vnitřní fluorescenci N.D Snížení intenzity NotchClean-up Short-passBand-passCut-off or long pass 3 22 Zdroje a filtry barevně http://probes.invitrogen.com/resources/edu cation/tutorials/3Light_Sources_Filters/pla yer.html 3 23 Geometrie při měření fluorescence Převzato z J.R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Third Edition,Springer, 2006 Kyveta shora Dopadající excitující světlo Emitované světlo 3 24 Efekt vnitřního filtru Intenzita fluorescence se při určité hodnotě absorbance (zpravidla od Abs kolem 0,1) začíná chovat nelineárně. To je způsobeno tím, že vrstvy vzorku vzdálenější od roviny dopadu budícího záření na vzorek jsou excitovány nižší intenzitou světla, neboť část budícího záření je absorbována povrchovými vrstvami. Tato chyba se projevuje jen u silněji absorbujících roztoků, ale při přesném měření kvantových výtěžků je nutno ji vždy uvažovat a korigovat. Převzato z J.R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Third Edition,Springer, 2006 3 25 Vliv koncentrace na tvar a polohu maxima emisního spektra Převzato z J.R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Third Edition,Springer, 2006 3 26 Vliv nastavení šířky štěrbin na tvar spektra Převzato z J.R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Third Edition,Springer, 2006 3 27 Časté chyby při přípravě fluorescenčních vzorků * Koncentrace je příliš vysoká ­ používejte zředěné roztoky s Abs pod 0.05 * Kontaminace rozpouštědla nebo kyvety - vždy ověřujte pozadí tj. změřte fluorescenční spektrum samotné kyvety pouze s rozpouštědlem * Pevné částice v roztoku ­ přefiltrujte roztok 3 28 Dokumentační systém ,,inteligentní temná komora" Umožňuje stanovit hodnotu lokální optické absorpce i fluorescence Zdrojem univerzálního budícího záření je zpravidla transiluminátor, který emituje v UV oblasti. Zdrojem selektivního budícího záření jsou LED diody na bočních stranách Emise je sledována (digitálním) fotoaparátem nebo chlazeným CCD detektorem CCD detektor nebo fotoaparát Karusel s emisními filtry LED diody pro boční osvit a excitaci Polohovatelná osvitová deska s transiluminátorem (UV) nebo prosvětlovacím zařízením (VIS) Převzato z přístrojové dokumentace FUJI 3 29 Fluorescenční scanner * Snímá oblast a sleduje závislost intenzity emise fluorescence při daném excitačním záření (zdrojem je zpravidla laser) ˇPoužívá se k detekci fluorescenčně značených a barvených molekul po elektroforetické separaci 3 30 Čtečka mikrodestiček Převzato z přístrojové dokumentace Biotek 3 31 Fluorescenční mikroskop Hlavní rozdíl oproti spektrometrům : nepoužívá monochromátory,ale excitační a emisní filtr Převzato z J.R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Third Edition,Springer, 2006 http://micro.magnet.fsu.edu/primer/java/ lightpaths/fluorescence/index.html 3 32 Praktické ukázky a soutěžní srovnání přístrojů * Merění absorbčního, fluorescenčího emisního a excitačního spektra * Vizualizace fluorescenčně značené DNA po elektroforetické separaci