10 1 Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii Ctirad Hofr Nevlastní fluorescence 29.11.2007 10 2 Dá se vnitřní fluorescence proteinů použít k určení koncentrace? * Jenom ve velmi omezené míře a pouze u některých proteinů (závislost emise tryptofanu na poloze ve struktuře proteinu, vzájemné zhášení fluorescence AK přenosem energie) * Při použití vnějšího značení je stanovení koncentrace mnohem přesnější 0 2 4 6 8 220 240 260 280 300 320 (nm) (M-1 cm-1 ) 0 0,5 1 250 300 350 400 (nm) IntenzitaFluorescence Absorbance Fluorescence Trp Tyr Phe 10 3 Nevlastní fluorofory Vnější, neboli nevlastní fluorofory se používají mnohem více než vnitřní. fluorescenční značky - přidávají se ke studovanému vzorku a vážou se na něj kovalentně. Vážou na proteiny a nukleové kyseliny přes aminové, sulfhydrylové nebo histidinové boční řetězce a thiolové skupiny. fluorescenční sondy - vážou se na studovaný vzorek nekovalentně a po vazbě mění svoje fluorescenční vlastnosti (např. intenzitu, polohu em. maxima) 10 4 Absorpce biologického materiálu * Biologický materiál absorbuje relativně nejméně v intervalu (500,600) nm * Nejnižší přirozené fluorescenční pozadí je v rozsahu 400-500 nm * Také proto se používají sondy a značky, které mají excitaci a emisi v tomto intervalu * Hlavně ale, aby mohly být značené biomolekuly studovány i za přítomnosti neznačených proteinů, musí mít značky a sondy větší excitační a emisní vlnovou délku než vnitřní fluorofory (aromatické AK) tj. 400-600 nm 10 5 Fluorescenční značky Vhodná značka pro kovalentní vazbu k biomolekule by měla mít následující parametry: - vysoká intenzita fluorescence - stabilita i při souvislém ozařování - minimální vliv na biologické chování studované molekuly 10 6 Svítivost značky (Brightness) * je dána součinem kvantového výtěžku a molárního extinkčního koeficientu Bs = Q * Dobrý parametr pro účinnost s jakou značka přeměňuje excitační světlo na fluorescenci * Po kovalentní vazbě k biomolekule často dochází k výrazné změně ve svítivosti * Pro praxi je vhodné mít značku se svítivostí Bc>5000 10 7 Příklady fluorescenčních značek * dansyl chlorid (DNS-Cl; 5-dimetylaminonaftalén-1-sulfonyl chlorid) * fluorescein-5-izothiokyanát (FITC) * 5-jodoacetamidofluorescein (5-IAF) * tetrametylrhodamin-5(a 6)-izothiokyanát (TRITC) * 4-chloro-7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol (NBD-Cl; 4-chloro-7-nitrobenzofurazan) * 6-akryloyl-2-dimetylaminonaftalén (akrylodan) 10 8 Dansyl chlorid * Jedna z prvních a z toho důvodu také v literatuře nejvíce zastoupených fluorescenčních značek * Často se používá ke značení proteinů je výhodný zejména při měření anizotropie * Velmi vhodná doba dohasínání fluorescence ~ 10 nm * Je excitován při 350 nm, kde proteiny neabsorbují * Emisní spektrum je velmi citlivé na polaritu roztoku a má maximum většinou kolem 520 nm * Reaguje s volnými aminoskupinami proteinů 0 2 4 6 8 220 240 260 280 300 320 (nm) (M-1 cm-1 ) Absorpce proteinů Trp Tyr Phe 10 9 Fluorescein a rhodaminy * Patří k nejrozšířenějším fluorescenčním značkám * Abs.max. Em. max. fluorescein (490nm) (520) rhodaminy (600 nm) (530-620) * Nejsou citlivé na polaritu solventu a na pH * vysoká hodnota ~ 80 000 M-1cm-1 * Vysoký kvantový výtěžek Q ~ 0.3-0.8 * Doba dohasínání fluorescence ~ 4 ns * je syntetizováno velké množství derivátů, které se používají ke značení proteinů a DNA přes NH2 skupinu nebo SH skupinu * Intenzita fluorescence je závislá na pH * Mají sklon k fotovybělování FITC 10 10 BODIPY * Nástupce fluoresceinových a rhodaminových značek * Odvozeny od fluoroforu, který obsahuje Bór * Emisní maxima 510-675 nm * Extrémně vysoký kvantový výtěžek Q~ 1! * Nejsou citlivé na polaritu solventu a pH * Emisní spektrum je úzké a emise je tak soustředěna na úzký rozsah vlnových délek a múže být rozlišeno více různých značek ve směsi * Nevýhodou je malý Stokesův posuv, jehož důsledkem je poměrně malá hodnota Försterovy vzdálenosti při rezonančním přenosu energie (R0=57 A) * Díky významnému překryvu emisního a absorpčního spektra dochází k samozhášení při vysoké koncentrací značení(když jsou molekuly fluoroforu blíže než R0) * Nejsou vhodné pro FRET aplikace 10 11 Cy značky * Velmi populární * Číslo znamená délku řetězce konjugovaných vazeb mezi dvojicí aromatických jader * Vhodné pro oblast od 550 nm dále * Relativně malý Stokesův posuv * Používají se pro FRET studie 10 12 Alexa Fluor * Vysoký kvantový výtěžek -> vysoká svítivost * Zlepšená rozpustnost ve vodě * Malá závislost fluorescence na pH * Fotostabilní ! 10 13 Fotostabilita fluoroforů * Po určitém času dojde u každého fluoroforu k fotovybělení * Nejdůležitější je fotostabilita při mikroskopii, kde se používají vysoké intenzity excitačního světla * Nejvyšší fotostabilitu ukazují sondy skupiny Alexa * Zatím nebyla zjištěna žádná spojitost mezi strukturou fluoroforů a jejich fotostabilitou 10 14 Vliv míry značení na intenzitu fluorescence * U klasického fluoresceinu a rhodaminů při vysoké hustotě značení (molekuly fluoroforu jsou ve vzdálenosti kolem R0) často dochází k samozhášení * V případě Alexa fluoroforů ke zhášení v takové míře nedochází a to je důvodem vetší intenzity emise v případě vyšší hustoty značení 10 15 Real-time PCR detekce amplifikace DNA Zhášedlo Emitor F primer R primer 1.Značená sonda se hybridizuje s komplementární sekvencí. Záření Emitoru je zhášeno a není pozorováno. 2.Při polymerizaci dochází k nahrazení sondy novým řetězcem. 3.Při každém amplifikačním cyklu odštěpuje polymeráza Emitor, jehož záření je detekováno 4.Polymerizace je dokončena. Intenzita emitovaného záření je přímo úměrná množství amplifikované DNA. 10 16 Fluorescenční značky pro RT-PCR * Které z daných značek je nejvhodnější použít? 10 17 Fluorescenční sondy * Fluorescenční sondy jsou nevlastní fluorofory, které se ke sledované struktuře vážou nekovalentně a často přitom mění své fluorescenční vlastnosti. Fluorescenční sondy jsou sami v roztoku zpravidla velmi málo fluorescenční. Po vazbě na proteiny nebo DNA se však jejich fluorescence velmi výrazně zvýší. 10 18 Sondy citlivé na polaritu prostředí Typickými sondami pro dynamickou polaritu jsou 1-anilinonaftalén-8-sulfonát (ANS) a 2-ptoluidinonaftalén-6-sulfonát (TNS). V tabulce jsou uvedeny fluorescenční parametry ANS v různých rozpouštědlech vyplývá, že s rostoucí polaritou rozpouštědla se emisní maximum fluorescence ANS posouvá do červené oblasti a současně klesá kvantový výtěžek a doba dohasínání. Při vazbě ANS k apomyoglobinu se ANS váže do nepolárního vazebného místa pro hem a lemmax se posunuje na 454 nm a kvantový výtěžek fluorescence vzrůstá na 0,98. Tímto způsobem lze studovat strukturu a stupeň polárnosti různých vazebných míst na proteinech včetně případného vytěsňování fluorescenčních sond z této vazby nebo změny vyvolané např. aktivací enzymu apod. ANS bylo použito např. pro studium polarity vazebného místa pro hem v apomyoglobinu a apohemoglobinu, nebo konformačních změn ve svalech a v nervových zakončeních během akčního potenciálu. TNS bylo využito např. pro studium konformačních změn po aktivaci chymotrypsinogenu a změn konformace nervové membrány. 0,550,004515voda 6,050,216476metanol 10,20,476466propanol 12,30,646464oktanol doba dohasínání (ns) kvantový výtěžek em max (nm) rozpouštědlo Parametry fluorescence sondy 1-anilinonaftalén-8-sulfonátu (ANS) při různé polaritě rozpouštědla 10 19 Změna fluorescence sérového albuminu v přítomnosti ANS * Při zvyšování poměru molekul ANS:SA dochází k posunu emisního maxima z 350 nm na 480 nm * To se projeví zvýšením intenzity záření, které vidíme okem při excitaci 280 nm 10 20 DNA sondy * Interkalátory EB, AO, TOTO se vážou vmezeřením mezi páry bazí * Hoechst, DAPI se vážou do malého žlábku DNA * EB zvyšuje intenzitu fluorescence po vazbě 30x a se prodlužuje z 2 na 20 ns * DAPI zvyšuje intenzitu fluorescence nejvíc v blízkosti AT párů * TOTO (Thiazole Homodimer) zvyšuje intenzitu fluorescence po vazbě 1100x * Sondy s velkou afinitou jak EB homodimer (váže se 10 000x pevněji než monomer EB) a kladně nabitý TOT0 zůstávají navázané na DNA i během elektroforézy a používají se k vizualizaci DNA na gelu a umožňují zvýšit citlivost až 500x ve srovnání s klasickým barvením EB * Jak je možno snížit spotřebu sondy? 10 21 Syber Green * Selektivně se váže na ds DNA do malého žlábku * Detekce od 1 ng/mL * Využití při RT PCR ke kvantifikaci namnožené DNA Taq 10 22 Proteinové sondy * Zvyšují intenzitu fluorescence po vazbě na protein * Nejcitlivější fluorescenční sondy pro barvení proteinů v gelu jsou ze skupiny organokovových sloučenin SYPRO * SYPRO Red, Orange, Tangerine, Rose * Vysoká citlivost ~ ng/mL * Před použitím je nutná kyselá fixace 10 23 Sypro sondy * Primárně používané při barvení proteinů na gelu * Využití v kriminalistice 10 24 Současné barvení DNA a proteinů na gelu * DNA byla barvena Syber Green * Protein SYPRO Ruby 10 25 Indikátory iontů * Fluorescenční měření změn nitrobuněčných iontů je možně díky sondám, které mění své spektrální vlastnosti po vazbě daného iontu. Nejčastěji se měří Ca2+, kterému je věnována řada knih. Indikátory jsou obvykle deriváty chelátorů Ca2+, Mg2+, Na+ nebo K+ jako je EGTA, APTRA a BAPTA, které mají vhodnou afinitu pro studovaný iont. Při výběru vhodného indikátoru bereme v úvahu: * formu indikátoru (sůl, acetoxymetyl ester, dextranový konjugát), která ovlivňuje způsob, jakým se dostává do buňky (mikroinjekce, elektroporace, infúze z patch-pipety, pasivní difúze) a nitrobuněčnou distribuci * způsob měření ­ některé indikátory vykazují po vazbě iontu spektrální posuv absorpce nebo emise (měří poměr intenzit při různých vlnových délkách excitace nebo emise), jiné změnu intenzity fluorescence * disociační konstantu ­ musí být srovnatelná s měřenou koncentrací kationu (koncentrace menší než desetina nebo věší než desetinásobek disociační konstanty způsobují příliš malé změny v pozorovaném signálu) 10 26 Indikace Ca2+ v nervových buňkách za použití Fluoro-3 10 27 Quantum dots * Základem je polovodičový materiál * částice o velikostí řádově nm * Mají úzké symetrické spektrum * Nedochází k fotovybělování! * Emisní vlnová délka je dána průměrem a materiálem částice * Široký rozsah emise od UV do IR 10 28 Vazba biomolekul na Qdots * Jádro je tvořeno polovodičem CdS pro UV, CdSe pro Vis a CdTe pro IR * Velikostí je srovnatelné s rozměrem GFP * Jádro je pokryto pláštěm (shell), který umožňuje spojení jádra s vnější hydrofilní vrstvou (Polymer coat) * Vnější hydrofilní vrstva udává rozpustnost a umožňuje vazbu biologických molekul 10 29 Vlastnosti QDots * Šířka emisního spektra je 20-30 nm, což 1/3 hodnoty ,,klasických" fluoroforů * Kvantový výtěžek 0.35-0.5 * Absorbují při každé vlnové délce (polovodič) * Mohou emitovat při různé vlnové délce za stejného budícího záření! * Ultrafotostabilní 100-krát odolnější proti fotovybělování než ,,klasické" organické fluorofory * Doba dohasínání ~ 100 ns * Vysoký ~ 10 000 000 M-1c-1 10 30 Srovnání velikosti QDot 10 31 Aplikovatelnost fluorescenčního značení * Rozdíl mezi lidským a opičím karyotypem * Fluorescenční značení pomáhá odpovědět na základní vědecké otázky 10 32 Literatura * Lakowicz J.R.: Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third Edition, Springer + Business Media, New York, 2006. * Fišar Z.: FLUORESCENČNÍ SPEKTROSKOPIE V NEUROVĚDÁCH http://www1.lf1.cuni.cz/~zfisar/fluorescence/Default.htm Grafika z knihy Principles o Fluorescence byla pro účely této přednášky laskavě poskytnuta profesorem J.R. Lakowitzem. Poděkování