11
1
Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii
Ctirad Hofr
Fluorescenční značení
molekul
5.12.2007
11
2
Nevlastní fluorofory
fluorescenční značky - přidávají se ke
studovanému vzorku a vážou se na něj
kovalentně. Vážou na proteiny a nukleové kyseliny
přes aminové, sulfhydrylové nebo histidinové
boční řetězce a thiolové skupiny.
fluorescenční sondy - vážou se na studovaný
vzorek nekovalentně a po vazbě mění svoje
fluorescenční vlastnosti (např. intenzitu, polohu
em. maxima)
11
3
Možnosti zavedení fluoroforu
* Kovalentní vazba
využívá se chemické reakce derivátu fluoroforu,
během které se vytváří kovalentní vazba
s biomolekulou
* Nekovalentní vazba
fluorofor s váže na biomolekulu prostřednicvím
nekovalentních (např. elektrostatických)
interakcí
* Fluorogenní reakce
využívá se chemické reakce, při které se
nefluorescenční prekurzor mění na fluorofor
11
4
Estery
Vznikají reakcí karboxylové kyseliny a alkoholu
R C
O
O H
R´ OH R C
O
O R´
OH2+ +
karboxylová kyselina alkohol ester
11
5
Vznik amidu
Amidy vznikají reakcí esteru s aminem
ester amin amid
R´´NH2
R C
O
O R´
R C
O
N
H
R´´
+
11
6
Reakce esterů při kovalentím
značení molekul s NH2 skupinou
Využívá se
reakce esteru
s aminem za
vzniku amidu
11
7
Reakce karboxylové kyseliny značky Alexa 488
s NH2 skupinou proteinu
Alexa Fluor 488 carboxylic acid, 2,3,5,6tetrafluorophenyl
ester (Alexa Fluor 488
5-TFP)
+
NH2
NH
R´
R
R´´
11
8
Jak přidat NH2 skupinu k DNA?
Rovnou při syntéze oligonukleotidu se
připojí alyfatický řetězec zakončený NH2
skupinou (amino-linker)
Modifikace 5´ konce amino linkerem
11
9
Značení DNA přes NH2 skupinu
Rhodamine RedTM-X,
succinimidyl ester
+ NH2
DNA s ,,amino-linkerem"
11
10
DNA značená Rhodaminem Red-X a
OregonGreen
11
11
Další reakce pro značení přes
amino skupinu
Reakce isothiokyanátu s primárním aminem
Reakce chloridu sulfonové kyseliny s aminem
11
12
Připojení přes SH thiolovou
skupinu za vzniku thioetheru
* Thioether je podobný esteru, jenom je O
nahrazen S
* Thioether vzniká reakcí alkylačních činidel
(např.halogenů, maleimidů) s thioly
(obsahují SH skupinu)
S
R1 R2
11
13
* Reakce thiolové skupiny s maleimidem za
vzniku thioetheru
* Dvojná vazba maleimidu reaguje s thiolovou SH
skupinou za vzniku thioetheru
Reakce při kovalentím značení s
SH skupinou molekul
11
14
Další reakce pro značení molekul
se skupinou SH
Iodoacetamidy ?
Disulfidy
11
15
Další způsoby značení
* DNA může být kovalentně
značena bez připojení NH2
skupiny při syntéze
* Využívá se reaktivity N7
guaninu s platinovými
komplexy
* Platinový komplex obsahuje
fluorescenční značku, která
je po reakci kovalentně
připojena ke guaninu
11
16
Separace nenavázané značky
* Chromatografie (protein)
gelová filtrace
* Srážení (DNA)
11
17
Chemické značení proteinů in vivo
http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/fulltext/114262216/HTMLSTART
* A)Receptor-protein ­
fluorescenční značka nebo sonda
je připojena k moleklule, která má
vysokou afinitu
k receptoru (avidin - biotin)
* B) Vazba zprostředkovaná
enzymem ­ fluorofor je připojen k
substrátu, který může být
kovalentně navázán na peptidový
,,tag" proteinu prostřednictvím
dalšího proteinu -enzymu
* C) Značka původně
nefluoreskuje. Po její vazbě k
,,tagu" dochází k aktivaci
fluorescence (fluorogenní reakce)
11
18
Fluorogenní detekce
In vivo labeling of -gal by a
fluorogenic probe with spectral
change. The labeling is proposed
to take place in two steps. The
first step involves O-galactoside
bond cleavage, which generates
an active intermediate quinone
methide. This intermediate is
susceptible to nucleophilic attack
by a nearby amino acid residue,
which leads to covalent
attachment of the FRET donor
(D) to the enzyme and
displacement of the acceptor (A).
http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/fulltext/114262216/HTMLSTART
11
19
DNA beacons
* Beacon zn. angl.signální oheň,
lampa (ne slanina)
* DNA beacon sestává z
molekuly DNA, která je
schopna tvořit vlásenkovou
strukturu
* DNA má na jednom konci
připojen fluorofor a na druhém
jeho zhášedlo
* Při hybridizaci s
komplementární DNA dochází
k oddálení zhášedla a
následné emisi fluorescence
11
20
Struktura a vlastnosti ,,DNA beacon"
Při zvyšování teploty
dochází k tání
struktury vlásenky,
což se projevuje
vzrůstem intenzity
fluorescence
Pozn. V případě Dabcylu byla zjištěna neočekávaná schopnost zhášet široké spektrum
fluoroforů bez ohledu na míru překryvu spekter. Důvodem pro toto univerzální zhášení je
pravděpodobně vytváření nefluorescenčního komplexu Dabcylu s fluoroforem.
Každopádně je to výhodné, protože jedno zhášedlo může být použito pro celou řadu
fluoroforů.
11
21
Použití Dabcyl-Fluorescein páru na
,,DNA beacon" ke sledování PCR
Intenzita
fluorescence je
přímo úměrná
množství
amplifikované DNA
Počet cyklů
11
22
Vysoká citlivost DNA beacon
* V případě, že dojde k
hybridizaci s DNA,
která se liší i pouze v
jednom nukleotidu,
nedochází k nárustu
signálu fluorescence
* Vysoká citlivost a
poměr on/off signálu
v přítomnosti /
nepřítomonsti
komplementární DNA
11
23
Hybridizace v sousedních oblastech
* Výhodné uspořádání ke snížení
falešně pozitivních výsledků
* Používají se dvě vlásenky
* Jedna vlásenka obsahuje donor a
druhá akceptor FRET
* Bez cílové DNA jsou oba fluorofory
ve vlásence zhášeny
* V případě, že dochází ke správné
hybridizaci s cílovou DNA, je
pozorován FRET
* Když se hybridizuje pouze jedna
vlásenka, dochází sice ke zvýšení
intenzity, ale nezvyšuje se FRET
* Tak se zvyšuje specifita analýzy
11
24
Detekce mRNA v živých buňkách
* Optické a fluorescenční
zobrazení ledvinových
buňek
* Zvyšování intenzity
fluorescence ,,DNA
beacon" proti mRNA pro
-actin prokázalo zvýšení
koncentrace mRNA a
tedy zvýšení produkce
-actinu
11
25
FISH (fluorescence in situ
hybridization)
* DNA ve formě metafázových chromozomů je vystavena hybridizaci
s fluorescenčně značenou DNA sondou
* DNA sonda má sekvenci komplementární k cílové DNA na chromozomu
* Po hybridizaci je část obsahující cílovou DNA lokalizována na základě
fluorescence
11
26
Fluorescenční deoxyribonukleotidy
pro syntézu FISH DNA sond
11
27
FISH příklady
* Chromozomy, které byly hybridizovány
s fluorescenčně značenými sondami
* Chromozomální DNA byla nespecificky obarvena DAPI
11
28
Radioaktivní sekvenování
* Prvotní sekvenování používalo
radioakativně značený primer
* Primer byl prodlužován podle
sekvenovaného řetězce DNA
polymerázou
* Ve směsi normálních nukleotidů
(dNTP) byl přidán vždy jeden typ
(ddNTP), který zabraňuje dalšímu
prodlužování syntetizovaného řetězce
* Takto vzniká směs řetězců DNA s
proměnlivou délkou končící vždy
daným ddNTP
* Každá reakční směs pro daný ddNTP
byla analyzována v jedné
elektroforetické jamce (celkově ve 4
jamkách)
* Sekvence byla stanovena z polohy
pásu příslušného ddNTP na gelu
11
29
Schéma ddNTP DNA
* Dideoxynukleotidtrifosfát
ddNTP
* v poloze 3´ u ribózy
je zaměněna OH
skupina za H, což
zamezuje dalšímu
prodlužování řetězce
DNA
11
30
Fluorescenční značení zrychlilo
sekvenování
* Použití 4 fluorescenčních
značek umožnilo použít pouze
jednu dráhu v gelu k
identifikaci všech nukleotidů
* Fluorescenční skenování
umožnilo dokončit projekty
sekvenace genomu celých
organismů ve výrazně kratší
době
11
31
Fluorescenční značky pro
sekvenaci
Připojení značky přes acetylénovou trojnou vazbu
Všechny značky se excitují jedním laserem (488nm)
A system for rapid DNA sequencing with fluorescent chain-terminating dideoxynucleotides
JM Prober, GL Trainor, RJ Dam, FW Hobbs, CW Robertson, RJ Zagursky, AJ Cocuzza, MA Jensen, and K Baumeister
Science 16 October 1987 238: 336-341
11
32
Sekvenování DNA
http://www.wiley.com/college/pratt/0471393878/stu
dent/animations/dna_sequencing/index.html
* Nejčastější sekvenační primer M13:
5'- gTA AAA CgA Cgg CCA gTg -3,
11
33
Ukázka sekvenátoru
11
34
Literatura
* Lakowicz J.R.: Principles of Fluorescence
Spectroscopy. Third Edition, Springer +
Business Media, New York, 2006.
* Fišar Z.: FLUORESCENČNÍ SPEKTROSKOPIE
V NEUROVĚDÁCH
http://www1.lf1.cuni.cz/~zfisar/fluorescence/Default.htm
Grafika z knihy Principles o Fluorescence byla pro účely této přednášky
laskavě poskytnuta profesorem J.R. Lakowitzem.
Poděkování