13
1
Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii
Ctirad Hofr
Analytické aplikace
fluorescence
13.12.2007
13
2
Určení koncentrace DNA
* Pomocí absorpční spektroskopie je možno
přesně určit koncentraci až do limitu 1 g/ml
* Použití fluorescenční sondy umožňuje snížit limit
detekce 1000krát - na 1 ng/ml!
* Při použití fluorescenčních sond na měření
koncentrace komplexních vzorků (buněčný lyzát,
krevní plazma ) je menší vliv přítomnosti
proteinů (absorbují při 260nm), nukleotidů a
krátkých oligonukleotidů
* Přesnost měření je kolem 5%
13
3
Stanovení koncentrace DNA
pomocí Hoechst 33258
* Standard - roztok DNA od
5 ­ 1000 nM
* Smíchání s roztokem
Hoechst (200 ng/ml) v
poměru 1:1
* Ex/Em 350/455 nm
* Měřeno v TE pufru
* Spotřeba vzorku ~ 50 ng
DNA
13
4
Stanovení koncetnrace DNA
pomocí PicoGreen
* Detekce 25 pg/ml
* Ex/Em 480/520
nm
* Velký dynamický
rozsah ­ lze
stanovit
koncentraci od
0.025 -1000 ng/ml
13
5
Určování koncentrace proteinů
* UV absorpce - stanovení na základě
absorpce aromatických AK ­ je
závislá na jejich výskytu v sekvenci
(1 mg/ml)
* Bradfordové metoda ­ založená na
změně zbarvení po vazbě na protein
(0.25 mg/ml)
* Fluorescenční metody (10 ng/ml)
13
6
Fluorescenční stanovení
koncentrace proteinů
* Při použití fluorescenční
sondy NanoOrange, je
potřeba vyrovnat rozdíly ve
struktuře proteinů, které by
ovlivňovali interakce ­ je
nutno je zdenaturovat
* Citlivost 10ng/ml
* Dynamický rozsah 1000
* Stabilní po dobu 6 hod
* Malá závislost na typu
proteinu
* Metoda není citlivá na
kontaminaci jinými
molekulami než lipidy
* Pro kvantifikaci v přítomnosti
lipidů nebo lipoproteinů lze
použít CBQCA kit
BSA
A) BSA, trypsin,
carbonic anhydrase
B) IgG, streptavidin,
RNase A
13
7
Stanovení množství za použití
densitometrie gelů
* Při analýze molekul v gelu je možno získat současně
informace o kvalitě i kvantitě
* Měří se množství absorbovaného/emitovaného světla v
závislosti na 2D poloze
* Stanovení koncentrace DNA a proteinu po barvení gelu
Coomasie, stříbrem nebo fluorescenčně
Zdroj světla
Detektor
13
8
Literatura
* Lakowicz J.R.: Principles of Fluorescence
Spectroscopy. Third Edition, Springer +
Business Media, New York, 2006.
* Fišar Z.: FLUORESCENČNÍ SPEKTROSKOPIE
V NEUROVĚDÁCH
http://www1.lf1.cuni.cz/~zfisar/fluorescence/Default.htm
Grafika z knihy Principles o Fluorescence byla pro účely této přednášky
laskavě poskytnuta profesorem J.R. Lakowitzem.
Poděkování