PCR v reálném čase ­ RQ PCR
Výhody PCR v reálném čase
V klasické PCR, kde detekujeme konečné produkty amplifikace, se může stát, že se v reakci,
kde byla už od počátku vysoká rychlost amplifikace vzorku, vyčerpá některá ze složek
reakčního mixu. Teoreticky ho pak mohou vzorky, u kterých reakce probíhala pomaleji,
"doběhnout" v několika cyklech PCR, což ale na gelu při klasickém způsobu stanovení na
gelu nerozeznáme (viz Dodatek).
RQ-PCR oproti tomu detekuje průběh reakce v každém kroku PCR cyklu. To je
umožněno měřením intenzity fluorescence, která narůstá závisle na amplifikaci
produktů, v přístroji, který obsahuje detektor pro snímání této fluorescence.
Templát TSR8 se využívá při stanovení aktivity telomerázy jako kontrola, jestli byly všechny
složky reakčního mixu v pořádku. TSR8 obsahuje sekvenci TS primeru a k němu připojených
8 telomerových repetic.
V PCR jsou produkty amplifikovány pomocí primeru TS a reverzního primeru Hutpr (na
obrázku RP), který obsahuje telomerovou sekvenci.
Postup
1. Připravte si devět 0,2 ml sterilních zkumavek
2. Namíchejte si reakční mix pro 10 reakcí (1 reakce navíc, kvůli chybě pipetování)
!!! všechny složky mixu rozpouštějte na ledu, na něm nechejte i namíchaný reakční mix
dokud nezačnete pipetovat.
Složení reakčního mixu na 1 reakci:
Reakční pufr 2 l
Polymeráza 0,2 l
Interkalátor 2,5 l
Primer mix 1 l
dNTP mix 0,5 l
25 mM MgCl2 2 l
Vzorek 2 l
H2O 14,3 l
___________
25 l
Interkalátor: Gel Star (ředěný 1:1000) ­ analog Sybr greenu
Polymeráza: Thermo-Start DNA Polymerase (5 U/l)
Primer mix: mix tvořený primery TS(forward) a Hutpr(reverse), konc. 5 uM
Vzorek: standard TSR8 (0,2 amol/l) a jeho ředění
vzorek o neznámé koncentraci
3. Příprava roztoků pro kalibrační křivku
Ze zásobního roztoku TSR8 připravte sérii ředění další dva roztoky, které budou tvořit
kalibrační křivku.
1. ředění (1:4) : ze zásobního roztoku TSR8 (0,2 amol/l) odeberte do čisté zkumavky 5 l a
přidejte k nim 20 l sterilní vody. Získáte 5x ředěný roztok.
2. ředění (1:20): z naředěného roztoku TSR8 (1:4) odeberte do čisté zkumavky 5 l a přidejte
k nim 20 l sterilní vody. Získáte 25x ředěný roztok.
Koncentrace TSR8 v zásobním roztoku je 0,2 amol/l. Spočítejte jeho koncentraci v
naředěných roztocích.
4. Pipetování
Rozpis reakcí:
do každé zkumavky napipetujte 23 l reakčního mixu a přidejte k nim:
1. 2 l sterilní vody (negativní kontrola)
2. 2 l TSR8 (1:25)
3. 2 l TSR8 (1:25)
4. 2 l TSR8 (1:5)
5. 2 l TSR8 (1:5)
6. 2 l TSR8
7. 2 l TSR8
8. 2 l neznámého vzorku
9. 2 l neznámého vzorku
5. Vzorky stočíte a vložíte do real-time cykleru Rotor Gene 3000 (Corbet Research).
6. Pod dohledem obsluhy spustíte analýzu, která trvá asi 150 minut.
Program na amplifikaci TRAP produktů má následující profil:
a. denaturace, aktivace polymerázy
94 C/15 min.
b. amplifikace produktů. Tento cyklus je opakován 40x.
94 C/30 sec
59 C/30 sec, v tomto kroku probíhá odečítání signálu na detektoru pro SybrGreen
72 C/30 sec
c. dosyntetizování produktů
72 C/5 min.
7. Vyhodnocení výsledků
Výstup dat z Rotor Gene 3000
získáme křivky, které udávají závislost intenzity fluorescence na počtu cyklů PCR reakce.
Pomocí softwaru přístroje křivky zanalyzujeme.
Dodatek
Princip stanovení aktivity telomerázy - klasicky
Po skončení reakce na gelu detekujeme žebříček produktů, které se liší o šest párů bazí, což je
délka jedné telomerové repetice.