Měření spektrálních charakteristik a stanovení koncentrace
DNA a proteinů
Spektroskopie v UV oblasti umožňuje stanovit koncentraci a čistou biologických molekul.
Molekuly DNA mají absorpční maximu v okolí 260 nm, molekuly proteinů v okolí 280 nm.
Pro přímé spektrální určení koncentrace se využívá Lambert-Beerova zákona pro
monochromatické světlo, který lze zapsat ve tvaru A = c. za předpokladu, měříme v 1 cm
kyvetě a známe extinkční koeficient , který má jednotku [M-1
cm-1
] pro molární koncentraci
nebo [mL.mg-1
cm-1
] pro koncentraci v mg/mL.
V případě, že neznáme extinkční koeficient můžeme pro určení koncentrace DNA o vysoké
molekulární hmotnosti použít zjednodušeného předpokladu, že roztok dvouřetězcové DNA o
absorbanci 1 má koncentrací 50 g/mL a pro převod na molární koncentraci nukleotidu DNA
pak vztah 320 g/mL = 1 mM.
Pro určení koncentrace proteinů v případě, že známe jejich sekvenci lze použít známé
extinkční koeficienty pro absorbanci při 280 nm nebo univerzální Bradfordové metodu, která
využívá posunu absorpčního maxima ,,Coomasie Blue" po vazbě na protein.
Materiál
* DNA (Salmon sperm)
* Oligonukleotid CNF2_Top (5´ CAATAGGAAACTCCCAAATC)
* Sérový albumin ( =: 0.677 ml mg-1
cm-1
, MW = 66430)
* TE pufr
* Kyvety
* Bardford reagent (BioRad)
* Spektrofotometr Beckman
Postup
DNA
Připravte roztok DNA v TE pufru ze zásobního roztoku o přibližné koncentraci 20 mg/mL
tak, aby bylo možno přesně určit koncentraci DNA.
Změřte absorpční spektrum DNA v rozsahu vlnových délek 220 až 350 nm.
Určete polohu absorpčního maxima.
Stanovte přesnou koncentraci DNA v zásobním roztoku z hodnoty absorbance naředěného
roztoku při 260 nm. Koncentraci vyjádřete v mg/mL a v OD/mL.
Nařeďte roztok oligonukleotidu v TE pufru tak, aby bylo spektroskopicky možno přesně
stanovit jeho koncentraci.
Na základě zadané sekvence oligonukleotidu stanovte extinkční koeficient 260 a
spektroskopicky určete jeho koncentraci.
http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/Default.aspx?c=EU
Porovnejte spektrum oligonukleotidu se spektrem fluorescenčně značeného oligonukleotidu
v rozsahu vlnových délek 220 až 600 nm.
Protein
UV spektroskopie
Připravte roztok BSA v TE pufru ze zásobního roztoku o přibližné koncentraci 10 mg/mL tak,
aby bylo možno přesně určit koncentraci BSA.
Změřte absorpční spektrum BSA v rozsahu vlnových délek 240 až 350 nm.
Určete polohu absorpčního maxima.
Stanovte přesnou molární koncentraci BSA v zásobním roztoku z hodnoty absorbance
naředěného roztoku při 280 nm.
Bradfordové metoda
Připravte standardní kalibrační křivku pro měření koncentrace proteinu Bradfordové metodu.
Změřte koncentraci BSA pomocí této metody.
Vezměte roztok reakčního Bradfordové činidla z lednice a nechte jej zahřát na pokojovou
teplotou a promíchejte.
Připravte roztoky blanku a standardů BSA o celkovém objemu 1mL do mikrozkumavek tak,
že do 980 L reakčního Bradfordové činidla přidejte vždy 20 L TE pufru, a 20 L 0.125
mg/mL , 0.25 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.75 mg/mL, 1 mg/mL a 1.25 mg/mL. Současně připravte
stejným způsobem roztok neznámého vzorku.
Všechny roztoky dobře promíchejte a nechte inkubovat 5 min při pokojové teplotě. Inkubace
by neměla přesáhnout 1h.
Nastavte spektrofotometr na 595 nm. Vynulujte roztokem blanku.
Změřte absorbanci roztoku standardů. Při měření postupujte od nejnižší koncentrace
standardu k nejvyšší.
Vytvořte kalibrační křivku.
Změřte absorbanci neznámého vzorku a pomocí kalibrační křivky určete jeho koncentraci.
Porovnejte hodnoty koncentrace zásobního roztoku BSA určené spektroskopicky při 280 nm a
pomocí Bradfordové metody.