Studium vazby molekul za použití anizotropie fluorescence
Změna anizotropie fluorescence je používána při popisu vzájemné interakce molekul.
V případě, že se fragment DNA s fluorescenční značkou volně pohybuje (rotuje) v roztoku, je
pozorovaná anizotropie relativně nízká. V případě, že dojde ke vzniku komplexu DNA a
proteinu, dochází k výraznému snížení pohyblivosti DNA s fluorescenční značkou, což má za
následek zvýšení anizotropie fluorescence. Takto změna anizotropie popisuje míru interakce
DNA a proteinu.
Materiál
* Fragment DNA (GTTTAGG)4 značený Rhodaminem Red X (ex = 572, em = 591 nm)
* Roztok proteinu (Myb DNA vazebná doména, MW = 11 kDa)
* Pufr P (200 mM NaCl, 50 mM fosfát sodný, pH 7.0)
* Spektrofluorometr vybavený polarizátory pro měření anizotropie fluorescence
* Mikrokyveta s magnetickým míchadlem
Postup
Připravit 1.4 mL roztoku fluorescenčně značeného fragmentu o koncentrací 20 nM v pufru P
Roztok důkladně promíchat a přenést do kyvety.
Změřit anizotropii fluorescence při ex = 572 nm, em = 591 nm, šířka štěrbin 8/8 nm. Měření
zopakujte 5X a zaznamenejte průměrnou hodnotu.
Připravit roztok 100L proteinu o zásobní koncentraci 100 M v pufru P a z něj naředit
200 L roztoku proteinu o koncentraci 10 M v P pufru.
Postupně přidávat 10 M roztok proteinu tak, aby celkový objem přidaného roztoku byl 1, 2,
5,10, 20, 50, 100, 200 L a po každém přídavku měřit hodnotu anizotropie fluorescence.
Postupně přidávat po alikvotech 100 M roztok proteinu tak, aby celkový objem přidaného
roztoku byl 20, 50, 80 L a po každém přídavku měřit hodnotu anizotropie fluorescence.
Provést úpravu hodnot anizotropie na změnu objemu po přídavku roztoků proteinu.
Vynést závislost hodnot anizotropie fluorescence na koncentraci přidaného proteinu.
Analyzovat křivku vazby proteinu a stanovit disociační konstantu Kd.
Obr. 1. Závislost anizotropie fluorescence značeného fragmentu DNA na koncentraci
proteinu.
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000
0,19
0,20
0,21
0,22
0,23
0,24
0,25
KD
1628 nanoM
FA(572,591)
protein (nanoM)