Mikroskopie živých rostlin značených GFP Příprava roztoků a pomůcek Sterilizační roztok * 5 g hypochlorid vápenatý * 100 ml dd H2O * 500 l 10 % Tritonu X 100 (výsledná koncentrace Tritonu X 100 je 0.05 %) Mícháme nejméně 2 hodiny, zbytek nerozpuštěné soli necháme sedimentovat a teprve pak používáme. Uchováváme 1 měsíc při 4 °C ve tmě. 0.05% roztok Tritonu X 100 * 100 ml dd H2O * 500 l 10 % Tritonu X 100 Musí být vždy sterilní; tzn. je nutno před každým použitím vysterilizovat. Pozn.: TRITON SLOUŽÍ JAKO SMÁČEDLO. JE NUTNÉ JEJ PŘIDAT DO STERILIZAČNÍHO ROZTOKU I DO VODY NA OPLACH SEMÍNEK MS médium 500 ml * 2.15 g MS * 0.25 g MES * 5 g sacharózy * upravíme pH na 5.7-5.9 pomocí 1M KOH * 5 g Plant agaru (1%) Sterilizujeme a po ochlazení rozléváme do Petriho misek sterilně ve flowboxu. Používáme ihned po ztuhnutí nebo uchováváme v lednici při 4 °C k pozdějšímu použití. Sterilní filtrační papíry Sterilní párátka Roztok 75 % etanolu na sterilizaci používáme na pinzetu, kterou si v roztoku namáčíme,ožehneme a použijeme na sterilní přípravu párátek a filtračních papírů Příprava Arabidopis DR5-GFP linií k mikroskopii Postup 1. Příprava MS pevného média 2. Sterilizace semínek 3. Výsev na pevné médium 4. Kultivace 5. Příprava mikroskopického preparátu 1. Příprava MS pevného média * podle základního rozpisu si připravíme tekuté MS médium a upravíme u něj pH * do láhve k naváženému Plant agaru přidáme tekuté MS médium * vysterilizujeme a po ochlazení sterilně rozlijeme v boxu do Petriho misek, kde necháme v nedovřených miskách médium ztuhnout 2. Sterilizace semínek * do mikrozkumavky o objemu 1.5 ml dáme potřebné množství semínek, které chceme vysít a dobře označíme * přidáme 1 ml sterilizačního roztoku, mícháme 15 minut Pozn. Nenecháváme ve sterilizačním roztoku déle, protože hypochlorid vápenatý je pro semínka toxický. DÁLE PRACUJEME STERILNĚ VE FLOWBOXU * semínka v mikrozkumavce opláchneme 3 x 0.05% roztokem Tritonu X 100 tak, že nejdříve zcela odpipetujeme sterilizační roztok a přidáme 1 ml 0.05% roztoku Tritonu X 100, zavřeme, otáčením mikrozkumavky dnem vzhůru promícháváme a následně roztok odebereme. * po trojnásobném propláchnutí přidáme 0.5 ml 0.05% roztoku Tritonu * do Petriho misky si připravíme sterilní filtrační papír * roztok se semínky nasajeme mikropipetou a přeneseme na filtrační papír v Petriho misce 3. Výsev na pevné médium * výsev na MS médium provádíme tak, že nabereme párátkem jedno semínko a lehce jej položíme na médium (NEZATLAČUJEME!) * po vysetí zavřeme misku, kterou dokola omotáme prodyšnou páskou SPOFAPOREM * takto připravené misky zabalíme do alobalu a inkubujeme 2 dny v lednici při 4°C, aby došlo k ,,probuzení" semínek z dormance (,,spánku") 4. Kultivace * po dvou dnech inkubace, následující den ráno vložíme misky vertikálně do kultivačního boxu s předem nastavenými podmínkami kultivačního cyklu: a) den-noc b) teplota ve dne c) teplota v noci d) vlhkost e) osvětlení podle pokynů vyučujícího 5. Příprava preparátu k mikroskopii * po asi 10 dnech máme na miskách malé semenáčky, které opatrně pinzetou přeneseme z média na podložní sklo s dd H2O * přikryjeme krycím sklíčkem a pozorujeme pod mikroskopem