Měření spektrálních charakteristik a stanovení koncentrace
DNA a proteinů
Spektroskopie v UV oblasti umožňuje stanovit koncentraci a čistotu biologických molekul.
Molekuly DNA mají absorpční maximum kolem 260 nm, molekuly proteinů kolem 280 nm.
Pro přímé spektrální určení koncentrace se využívá Lambert-Beerova zákona pro
monochromatické světlo, který lze zapsat ve tvaru A = c. za předpokladu, že měříme v 1 cm
kyvetě a známe extinkční koeficient , který má jednotku [M-1
cm-1
] pro molární koncentraci
nebo [mL.mg-1
cm-1
] pro koncentraci v mg/mL.
V případě, že neznáme extinkční koeficient, můžeme pro určení koncentrace DNA o vysoké
molekulární hmotnosti použít zjednodušeného předpokladu, že roztok dvouřetězcové DNA o
absorbanci 1 má koncentrací 50 g/mL a pro převod na molární koncentraci nukleotidu DNA
pak vztah 320 g/mL = 1 mM.
Pro určení koncentrace proteinů spektroskopicky lze využít absorbance proteinů při 280 nm.
Jestliže známe primární sekvenci aminokyselin proteinu, lze extinkční koeficient vypočítat
http://www.expasy.org/tools/protparam.html.Ze změřené absorbance pak určíme koncentraci
proteinu. Znalost extinkčního koeficientu není nutná v případě univerzální Bradfordové
metody. Bradfordové metoda je v současnosti nejrozšířenější způsob určování koncentrace
proteinu. Bradfordové metoda využívá posunu absorpčního maxima ,,Coomasie Blue" po
vazbě na protein. Za použití kalibrační křivky se známou koncentrací proteinu lze určit
skutečnou koncentraci neznámého proteinu nebo směsi proteinů.
Materiál
* DNA (Salmon sperm)
* Oligonukleotid CNF2_Top (5´ CAATAGGAAACTCCCAAATC)
* BSA (hovězí sérový albumin;  =: 0.677 ml mg-1
cm-1
, MW = 66430)
* TE pufr
* Bardford reagent (BioRad)
* Kyvety a spektrofotometr
DNA
1. Připravte roztok DNA v TE pufru ze zásobního roztoku o přibližné koncentraci 20
mg/mL tak, aby bylo možno přesně určit koncentraci DNA.
2. Změřte absorpční spektrum DNA v rozsahu vlnových délek 220 až 350 nm.
3. Určete polohu absorpčního maxima.
4. Stanovte přesnou koncentraci DNA v zásobním roztoku z hodnoty absorbance
naředěného roztoku při 260 nm. Koncentraci vyjádřete v mg/mL a v OD/mL.
5. Nařeďte roztok oligonukleotidu v TE pufru tak, aby bylo spektroskopicky možno
přesně stanovit jeho koncentraci.
6. Na základě zadané sekvence oligonukleotidu stanovte extinkční koeficient 260 a
spektroskopicky určete jeho koncentraci.
http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/Default.aspx?c=EU
7. Porovnejte spektrum oligonukleotidu se spektrem fluorescenčně značeného
oligonukleotidu v rozsahu vlnových délek 220 až 600 nm.
Protein
UV spektroskopie
1. Připravte roztok BSA v TE pufru ze zásobního roztoku o přibližné koncentraci
10 mg/mL tak, aby bylo možno přesně určit koncentraci BSA.
2. Změřte absorpční spektrum BSA v rozsahu vlnových délek 240 až 350 nm.
3. Určete polohu absorpčního maxima.
4. Stanovte přesnou molární koncentraci BSA v zásobním roztoku z hodnoty absorbance
naředěného roztoku při 280 nm.
Bradfordové metoda
1. Připravte standardní kalibrační křivku pro měření koncentrace proteinu Bradfordové
metodu.
2. Změřte koncentraci BSA pomocí této metody.
3. Vezměte roztok reakčního Bradfordové činidla z lednice a nechte jej zahřát na
pokojovou teplotou a promíchejte.
4. Připravte roztoky blanku a standardů BSA o celkovém objemu 1mL do
mikrozkumavek tak, že do 980 L reakčního Bradfordové činidla přidejte vždy 20 L
TE pufru, a 20 L 0.125 mg/mL , 0.25 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.75 mg/mL, 1 mg/mL a
1.25 mg/mL. Současně připravte stejným způsobem roztok neznámého vzorku.
5. Všechny roztoky dobře promíchejte a nechte inkubovat 5 min při pokojové teplotě.
Inkubace by neměla přesáhnout 1h.
6. Nastavte spektrofotometr na 595 nm. Vynulujte roztokem blanku.
7. Změřte absorbanci roztoku standardů. Při měření postupujte od nejnižší koncentrace
standardu k nejvyšší.
8. Vytvořte kalibrační křivku.
9. Změřte absorbanci neznámého vzorku a pomocí kalibrační křivky určete jeho
koncentraci.
10. Porovnejte hodnoty koncentrace zásobního roztoku BSA určené spektroskopicky při
280 nm a pomocí Bradfordové metody.