Stanovení DNA za použití Hoechst 33258
Určení koncentrace DNA je často základním krokem při analýze biologického materiálu
a je součástí mnoha laboratorních protokolů. Znalost přesné koncentrace DNA je důležitá
pro celou řadu technik (sekvenování, syntéza a klonování cDNA, transkripce RNA atd.)
Koncentrace DNA je nejčastěji měřena UV spektroskopií, odčítáním absorbance při 260
nm (Abs260 = 1 pro dvouřetězcovou DNA o koncentraci 50 g/mL; v 1 cm kyvetě).
Ke kvantifikaci nižších koncentrací DNA, než jsou detekovatelné za použití UV
spektroskopie lze použít bisbenzen imidový interkalátor Hoechst 33258, který se váže na
AT bohaté oblasti dvouřetězcové DNA a vykazuje zvýšenou fluorescenci za podmínek
vysoké iontové síly. Hoechst má excitační maximum kolem 350 nm a emituje v oblasti
450 nm. Citlivost Hoechst interkalátoru je přibližně 10ng/mL. Dynamický rozsah
použitelnosti Hoechst pro stanovení koncentrace DNA přesahuje 3 řády od 10ng/mL do
1g/mL DNA.
Materiál
* Spektrofluorometr
* Mirokyveta (100 L)
* Roztok DNA (Salmon sperm)
* Hoechst 33258 10 mg/mL ve vodě
* 10X TNE pufr
* Destilovaná voda
* 1X TE pufr, 10 mL
Příprava roztoků
Varování:Hoechst 33258 je možný karcinogen a mutagen. Při přípravě roztoku pracujte
v rukavicích, s respirátorem a v digestoři.
Hoechst 33258 roztok
Naředit 1ml zásobního roztoku Hoechst 33258(10 mg/mL) 9 mL destilované vody.
Uchovat v tmavé láhvi při 4°C až 6 měsíců
10 X TNE pufr
Rozpustit v 800 mL dest. vody:
12.11 g Tris Base, MW = 121.14
3.72 g EDTA, disodná sůl dihydrát, MW = 372.20
116.89 g NaCl, MW = 58.44
Nastavit pH na 7.4 koncentrovanou HCl
Doplnit dest. vodou do 1000 mL
Filtrovat (0.45 m)
Lze uchovat při 4°C až po dobu 3 měsíců
Pozn. Koncentrace NaCl a pH jsou důležité pro správnou vazbu Hoechst na DNA.
1 X TNE: Naředit 1 mL 10X TNE do 9 mL destilované vody.
2X Hoechst roztok na stanovení
Naředit 5 L Hoechst 33258
roztoku (1mg/mL) do 25 mL 1X TNE.
Uchovat za pokojové teploty.
Chránit před světlem.
Připravovat čerstvý každý den.
Nefiltrovat.
Standardní roztok DNA
Připravit 1mg/mL roztok DNA v 1X TNE.
Jemným poklepáním promíchat roztok v mikrozkumavce.
Uchovat při 4°C až 3 měsíce.
Vytvoření standardní křivky
1. Připravit tři následná ředění roztoku DNA v 1X TNE s koncentrací od 2g/mL
DNA do 200 ng/mL (např. 2000, 1200, 600, 200 ng/mL po 2mL)
2. Přidat vždy 100 L 2X Hoechst roztoku ke každé koncentraci 100 L
standardního roztoku DNA. Promíchat a pipetovat do mikrokyvety. Celková
koncentrace DNA standardu v kyvetě je nyní poloviční (1000, 600, 300, 100
ng/mL)
3. Připravit blank promícháním 100 L 1X TNE pufru a 100 L 2X Hoechst
roztoku.
Všechny standardy a vzorky s Hoechst uchovejte v temnu až do měření.
4. Zapněte Fluoromax-4 podle návodu.
5. Změřte intenzitu fluorescence v módu single point při ex= 350 nm a em= 450
nm, šířka šterbin (slits) 2nm/2nm, integrační čas 1s
6. Změřte nejdříve intenzitu fluorescence blanku, následně standardy.
7. Hodnoty intenzity zapište do tabulky a vyneste do grafu hodnoty intenzity
fluorescence standardů po odečtení hodnoty blanku.
Měření neznámého vzorku
1. Nařeďte neznámý vzorek v 1X TNE na celkový objem 100 L.
2. Přidejte 100 L 2X Hoechst roztoku.
3. Připravte 2 různá ředění neznámého vzorku.
4. Změřte intenzitu fluorescence neznámých vzorků.
5. Po odečtení intenzity blanku určete podle standardní křivky koncentraci DNA
v neznámém vzorku.
Výsledky
Stanovení koncentrace DNA v neznámém vzorku.