Vizualizace makromolekul při elektroforetické separaci
Fluorescenční značení lze využít při sledování elektroforetické migrace makromolekul.
V případě, že jsou protein a DNA naznačeny rozdílnou fluorescenční značkou, lze nezávisle
detekovat polohu DNA a proteinů a sledovat jejich vzájemnou interakci.
Materiál
* DNA fragment s navázanou fluorescenční značkou (EXmax=572 nm, EMmax=595 nm)
* protein s navázanou fluorescenční značkou (EXmax=488 nm, EMmax=515 nm)
* roztok akrylamidu 30% (akrylamid : bisakrylamid ~ 37:1)
* 5X TBE (450 mM Tris, 450 mM kys. boritá, 10 mM EDTA)
* pufr B (200 mM NaCl, 50 mM fosfát sodný pH 7.0)
* n-butanol nasycený vodou (45 mL n-butanolu smíchaný s 5 mL dest. vody)
* mikrozkumavky
* 6x nanášecí pufr (0.15% orange G, 0.03% xylene cyanol FF, 60% glycerol, 10 mM TrisHCl,
pH 7.6, 60 mM EDTA)
* aparatura pro horizontální elektroforézu
* dokumentační systém LAS 3000
Postup
Připravte směs pro horizontální akrylamidový gel tak, že smícháte odpovídající množství
zásobního roztoku akrylamidu a 5X TBE, tak aby výsledná koncentrace akrylamidu byla 7.5 %
v 0.25X TBE. Směs se po nalití do formy překryje vrstvou n-butanolu, aby mohlo dojít
k polymeraci bez přístupu vzduchu. Nechte 1 hod. polymerizovat na stole.
Připravte zásobní roztok fluorescenčně značené DNA v pufru B tak, aby byla jeho koncentrace 2
pikomol/L.
Připravte zásobí roztok fluorescenčně značeného proteinu v pufru B tak, aby byla jeho
koncentrace 5 pikomol/L.
Připravte vzorky do mikrozkumavek podle následující tabulky bez přídavku nanášecího pufru:
pouze
DNA
DNA:protein
pouze
protein
vše v l 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6 1:7 1:8 1:9 1:10
DNA (2 pikomol/l) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 protein
(5 pikomol/l) - 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 5
pufr B (Na-fosfát pH 7, 200 mM NaCl) 7,5 6,5 5,5 4,5 3,5 2,5 1,5 0,5 2 1 / 5
6x nanášecí pufr 2 2 2 2 2 2 2 2 2,5 2,5 2,5 2
Nechte 10 minut inkubovat za laboratorní teploty.
Sestavte aparaturu pro horizontální elektroforézu a naplňte ji 0.25X TBE pufrem.
Ke každému vzorku přidejte 1/5 celkového objemu 6x nanášecího pufru podle tabulky.
Vložte gel do elektroforetické vany.
Naneste vzorky na gel v pořadí jako je v tabulce.
Spusťte elektroforézu při napětí 40V. Po 30 min. zvyšte napětí na 80V a nechte pokračovat další
asi 2 hod.
Detekujte fluorescenci značené DNA na dokumentačním systému s nastavením budícího záření
na UV 312 nm DIA a detekčního filtru na 605nm DF40.
Detekujte fluorescenci značeného proteinu na dokumentačním systému s nastavením budícího
záření na BLUE 460 nm EPI a detekčního filtru na Y 515 nm -Di.
Porovnejte obě výsledná zobrazení a určete oblasti, ve kterých se vyskytují komplexy vzniklé
vazbou proteinu na DNA.
Obr. 1. Příklad překryvu zobrazení při různém fluorescenčním značení DNA a proteinu.