Vliv pH a teploty na spektrální vlastnosti fluoroforů
V tomto experimentu je ukázán vliv pH na fluorescenci a absorpci fluorescenční značky
fluoresceinu rozpuštěné ve stejné koncentraci v roztocích o různém pH. Je rovněž
demonstrován vliv teploty na intenzitu fluorescence.
Materiál
* fluorescein - NIST-traceable standard - 50 M (Molecular Probes, Invitrogen)
* mikrokyveta
* pufr 5 (20 mM MES, pH 5.0)
* pufr 7 (50 mM fosfát sodný, pH 7.0)
* pufr 9 (12.5 mM boritan sodný/kys. boritá, pH 9.0)
* spektrofluorometr vybavený kryostatem (chlazenou vodní lázní)
Postup
1. Připravte vzorky fluoresceinu 1000x naředěním roztoku NIST standardu jeho
přidáním 1,5 L do 1499 L roztoku pufru 5, pufru 7 a pufru 9.
2. Změřte excitační spektra vzorků při (em) = 515 nm
3. Změřte emisní spektra vzorků při (ex) = 488 nm
4. Změřte spektra při 20, 25 a při 37°C.
Obr. 1. Vliv pH na excitační a emisní spektrum fluoresceinu.
Výsledky
Při změně pufru z pH 7 na pH 5 a při zvýšení teploty dochází ke snížení intenzity
fluorescence fluoresceinu.
350 400 450 500 550 600
0,0
2,0x10
5
4,0x10
5
6,0x10
5
8,0x10
5
1,0x10
6
1,2x10
6
1,4x10
6
1,6x10
6
1,8x10
6
F.I.(s3/3nm)
 (nm)
pH7
pH5