Fyziologie kmenových buněkFyziologie kmenových buněk
Jiří Pacherník
E-mail: jipa@sci.muni.cz
Tel: 532 146 223 / 116Tel: 532 146 223 / 116
Podpořeno FRVŠ 540/2007
Dělení buněk (proliferace)Dělení buněk (proliferace)
Symetricky ­ vznikají dvě identické buňky
Diferenciační dělení ­ obě nově vzniklé buňky mají i nový fenotym, jsou dalším
stupněm v dané diferenciační linii
Asymetricky ­ jedna si zachovává původní fenotyp, druhá je již jiná
Diferenciace (rozrůzňování) buněkDiferenciace (rozrůzňování) buněkDiferenciace (rozrůzňování) buněkDiferenciace (rozrůzňování) buněk
- Buňky mění svůj fenotyp v na základě změny exprese svého genotypu v důsledku vnějších signálů.
- Regulace diferenciace je často provázána s proliferací (epigenetické změny v jádře během mitotického cyklu?).- Regulace diferenciace je často provázána s proliferací (epigenetické změny v jádře během mitotického cyklu?).
Kmenová buňka
aktuální <-> potencionální
Terminálně
diferencovaná buňka**
Přechodně/transientně
se dělící buňky (Progenitory)*
aktuální <-> potencionální
diferencovaná buňka**se dělící buňky (Progenitory)*
** Post-mitotické buňky = už se nikdy nedělí.
Ne všechny terminálně diferencované buňky
jsou post-mitotické.
* Často proliferují a mají schopnost
krátkodobé sebeobnovy.
Z hlediska schopnosti tvořit další buněčné typy se buňky dělí na:Z hlediska schopnosti tvořit další buněčné typy se buňky dělí na:
Totipotentní ­ mohou z nich vznikat všechny buňky daného živočišného druhu
Pluripotentní ­ mohou dát vznik všem buňkám budoucího jedince (všechny tři zárodečné listy)Pluripotentní ­ mohou dát vznik všem buňkám budoucího jedince (všechny tři zárodečné listy)
Multipotentní ­ může z nich vznikat větší počet buněčných typů dané buněčné řady
(Oligopotentní ­ podobné jako multipotentní, ale méně typů)
Unipotentní ­ dávají vznik jen dvěma typům buněkUnipotentní ­ dávají vznik jen dvěma typům buněk
Nullipotentní ­ mohou se pouze dělit, nemění fenotyp
totipotentní pluripotentní, multipotentní, ....totipotentní
buňky
pluripotentní, multipotentní, ....
buňky
Totipotentní buňkyTotipotentní buňkyTotipotentní buňkyTotipotentní buňky
- 1- až 8-buněčné embryo (= Embryonální nespecifikované - pouze savci)
- Omezené možnosti dělení (neprobíha transkripce; myš 2/4 b., člověk 8 b.)- Omezené možnosti dělení (neprobíha transkripce; myš 2/4 b., člověk 8 b.)
- Existují pouze přechodně
Ztráta totipotence v průběhu časné embryogeneze
- vznik nerovnoměrných podmínek pro růst buněk
- tento proces je ireverzibilní
http://biology.kenyon.edu/courses/biol114/Chap13/Chapter_13.html#fertilization
Dělení buněk 2-buněčného embrya, určení polarity a její vliv na další osud blastomerDělení buněk 2-buněčného embrya, určení polarity a její vliv na další osud blastomer
Magdalena Zernicka-Goetz 2006
M ­ meridiální / E - ekvatoriální
Orientace blastomer 4-buněčného embrya
a její vliv na zachování absolutní totipotence
těchto buněktěchto buněk
Pluripotentní buňkyPluripotentní buňky (savci)Pluripotentní buňkyPluripotentní buňky (savci)
a) In vivo: buňky vnitřní buněčné masya) In vivo: buňky vnitřní buněčné masy
buňky epiblastu / primitivního ektodermu
kmenové buňky teratomů (???)
(somatické kmenové buňky?)(somatické kmenové buňky?)
b) In vitro: embryonální kmenové buňky
embryonální zárodečné buňkyembryonální zárodečné buňky
embryonální nádorové buňky
(kmenové buňky teratomů)
(somatické kmenové buňky?)(somatické kmenové buňky?)
Kmenové buňky mohou být pluripotentní, multipotentní,...
ale pluripotentní nebo multipotentní buňky nemusí být kmenové.ale pluripotentní nebo multipotentní buňky nemusí být kmenové.
Boiani & Scholer 2005
KMENOVÉ BUŇKYKMENOVÉ BUŇKY
- Schopnost sebeobnovy = self-renewal
- Schopnost dávat vznik jiným typům buněk = pluripotence / multipotence / .....- Schopnost dávat vznik jiným typům buněk = pluripotence / multipotence / .....
- Společné znaky s embryonálními a nádorovými buňkami, nezralý fenotyp /
relativně nediferencované (= dlouhé telomery / vysoká aktivita telomeráz, specifickérelativně nediferencované (= dlouhé telomery / vysoká aktivita telomeráz, specifické
proteinové markery, velký jádro / plasmový poměr,...)
= VYHRAZENÉ (PROFESIONÁLNÍ) KMENOVÉ BUŇKY
- Některé somatické, terminálně diferencované buňky si zachovávají schopnost
sebeobnovy a v případě potřeby i multipotence, normálně jsou ale quiescentní
(spící)(spící)
= FAKULTATIVNÍ KMENOVÉ BUŇKY
- Některé diferencované buňky si také dlouhodobě zachovávají schopnost
proliferace, sebeobnovování a podílejí se tak na udržení homeostáze v tkáni
= Sebeobnovující se diferencované buňky= Sebeobnovující se diferencované buňky
KMENOVÉ BUŇKY PRIMÁRNÍ = existují ,,in vivo"
- dávají vznik buňkám dané buněčné struktury / tkáně / orgánu / (organismu)
KMENOVÉ BUŇKY PRIMÁRNÍ = existují ,,in vivo"
- dávají vznik buňkám dané buněčné struktury / tkáně / orgánu / (organismu)
- relativně pomalá proliferace
- jsou nejčastěji multipotentní, snad některé i pluripotentní či unipotentní
- jsou základním zdrojem buněk pro regeneraci organismu a homeostázi- jsou základním zdrojem buněk pro regeneraci organismu a homeostázi
- mají schopnost sebeobnovy (self-renewal) = in vivo asymetrické dělení
- s věkem jich ubývá, ale pravděpodobně nikdy během života jedince úplně nevymizí- s věkem jich ubývá, ale pravděpodobně nikdy během života jedince úplně nevymizí
profesionální SC
- v tkáni jsou lokalizovány ve specifické oblasti, ,,niche" (koutek)- v tkáni jsou lokalizovány ve specifické oblasti, ,,niche" (koutek)
- mají společné znaky s embryonálními a nádorovými buňkami = dlouhé telomery,
specifické proteinové markery, velký jádro / plasmový poměr,...
- ???- ???
Somatické kmenové buňkySomatické kmenové buňky
Zárodečné buňky
KMENOVÉ BUŇKY ODVOZENÉ/SEKUNDÁRNÍ = existují jen ,,in vitro"
- jsou připravené z populací pluripotentních embryonálních buněk, ze
zárodečných buněk, nebo z progenitorů embryonálních a dospělých tkání
- relativně rychle proliferují- relativně rychle proliferují
- některé jsou multipotentní (z embryonálních a dospělých tkání), některé
pluripotentní (embryonální původ)
- mohou být zdrojem buněk pro regeneraci organismu- mohou být zdrojem buněk pro regeneraci organismu
- mají schopnost sebeobnovy (self-renewal) = ,,asymetrické/symetrické" dělení
- mají společné znaky s embryonálními a nádorovými buňkami = dlouhé telomery,
specifické proteinové markery, velký jádro / plasmový poměr,...specifické proteinové markery, velký jádro / plasmový poměr,...
- ???
Embryonální kmenové buňky
-> odvozené z vnitřní buněčné masy-> odvozené z vnitřní buněčné masy
(Kmenové buňky epiblastu)
Embryonální zárodečné buňkyEmbryonální zárodečné buňky
-> odvozené z primordiálních zárodečných buněk
Embryonální nádorové buňkyEmbryonální nádorové buňky
-> odvozené z kmenových buněk teratomů
Somatické kmenové buňky odvozené
-> odvozené ze somatických kmenových buněk
Vybrané signální dráhy
Signální dráha LIF (leukemii inhibující faktor) -> gp130 signalling
Evolučně se zdá, že tato dráha hraje důležitou úlohu v regulaci pluripotentních
a snad i multipotentních buněk u živočichů obecně (prokázáno i u Drosophily)
Význam gp130 signalizace v průběhu embryogeneze
Boiani & Scholer 2005
Signální dráha FGFs (Fibroblastové růstové faktory)
Bottcher a Niehrs, 2005
Signální dráha TGF / BMPs
(Transformující růstový (growth) faktor (Transformující růstový (growth) faktor 
kostní (bone) morfogenetické proteiny)
CROSSTALK FGF & TGF DRÁHY TRANSDUKCE SIGNÁLUCROSSTALK FGF & TGF DRÁHY TRANSDUKCE SIGNÁLU
Potlačení sérového BMP přidaným FGF-2 => inhibice diferenciace hES
Massague, 2003
Signální dráha Wnts
http://www.stanford.edu/~rnusse/wntwindow.html
WntWnt
++
Signální dráha WntsSignální dráha Wnts
Signální dráha Hedgehog
sonic hedgehog (Shh), Indian hedgehog (Ihh)
off onoff on
Ptc ­ Patched Smo - Smoothened
off on
Signální dráha Notch
a) b)
a) klasická dráha signální transdukce Notch, po navázání ligandu (DSL rodina = Delta,
Brennan 2003
a) klasická dráha signální transdukce Notch, po navázání ligandu (DSL rodina = Delta,
Serrate, Lag-2; Jagged) dojde k odštěpení extracelulární části receptoru a následně
i intracelulární (NICD ­ Notch intacellular domain), ta translokuje do jádra a v dimeru
s CSL (= CBF1 ­ Cp binding factor 1) aktivuje transkripci.s CSL (= CBF1 ­ Cp binding factor 1) aktivuje transkripci.
b) dráha snad aktivovaná dosud neznámým faktorem, kdy dochází k aktivaci proteinu
Deltax, který pak inhibuje JNK a CBP/p300 aktivitu.
Signální dráha Notch
Signální dráha jaderných receptorů obecně
Boghog 2; Wikipedia
Signální dráha jaderných receptorůSignální dráha jaderných receptorů
ligandy
NR jaderné (nuclear)
receptory
NR
receptory
transkripce
TF
NR NR
transkripční
faktory
DNA
transkripceTF
TF
NR
DNA
sebeobnova x diferenciacesebeobnova x diferenciace
?differenciace x sebeobnova?
Pluripotentní, odvozené kmenové buňky
EGC
EpiSC
ESC
ECC
EGC
EPL ESCEPL
Embryonální kmenové buňky (Embryonic stem cell ­ ESC)
Embryonální zárodečné buňky (Embryonic germ cell ­ EGC)
Embryonální nádorové buňky (Embryonal carcinoma cell ­ ECC)Embryonální nádorové buňky (Embryonal carcinoma cell ­ ECC)
Kmenové buňky epiblastu (Epiblast stem cell ­ EpiSC)
Early-primitive ectoderm-like - EPL
Embryonální kmenové buňky
(Embryonic stem cell)(Embryonic stem cell)
ESC
- jsou odvozené z vnitřní buněčné masy blastocysty
- fenotypem odpovídají přibližně buňkám vnitřní buněčné masy (mESC,- fenotypem odpovídají přibližně buňkám vnitřní buněčné masy (mESC,
ICM ­ inner cell mass) nebo epiblastu (hESC, EpiSC)
- jsou pluripotentní- jsou pluripotentní
- přirozeně neexistují, pouze in vitro
- jsou nesmrtelné- jsou nesmrtelné
- mají schopnost si udržet stabilní genotyp (!?)
- po injikaci do imunitně tolerantního organismu tvoří teratomy
(důkaz pluripotence)(důkaz pluripotence)
- po injikaci do blastocysty mají schopnost tvořit kompletní chiméry
(známo jen u mESC, důkaz pluripotence)(známo jen u mESC, důkaz pluripotence)
Ontogeneze a diferenciační potenciál buněk vnitřní buněčné masy
Gilbert 1997 / Bílek 2004
Izolace myších ES buněk
3,5 dní p.c. 4-5 dní
Imuno-chirurgie
6-8 ddnů IVF
3,5 dní p.c.
ICM
4-5 dní
Fibroblastová výživná vrstva
TE Vyseknutí a
disociace ICM
Fibroblastová výživná vrstva
,,feeder"- tvořená MEF
Odstranění
PEF
Linie ES buněk na feederu MEF Homogenní populace ES buněk
Upraveno podle Kroupová 2004
TERATOM
Nádor, který obsahuje buňky více jak jednoho zárodečného listu, většinouNádor, který obsahuje buňky více jak jednoho zárodečného listu, většinou
všech tří. Tyto buňky mohou být fenotypu od časných stádií až po
terminálně diferencované
Teratomy jsou typické nádory původem ze zárodečných buněk (ovariální a
testikulární teratomy. Teratomy jsou jak benigní, tak maligní
(teratokarcinom)
Kmenové buňky teratokarcinomu = embryonální nádorové buňky
(Embryonal carcinoma (EC) cells)
CHIMÉRA
Organismus je směsí geneticky odlišných buněk / tkání / orgánů
Chimeričtí jedinci vzniklí injikací ES buněk (dárce) do blastocysty (příjemce)
Jsou směsí geneticky odlišných buněk na ůrovni všech tkání, a tak také vytváří
pohlavní buňky s genotypem jak dárce, tak příjemce!
Růst a kultivace ES buněk
PROLIFERACE ­ DIFERENCIACE - APOTÓSAPROLIFERACE ­ DIFERENCIACE - APOTÓSA
Existence a charakter ES buněk je udržován kombinací účinků vnějších
(extrinsic) a vnitřních (intrinsic) faktorů. Vnější faktory si ES buňky částečně(extrinsic) a vnitřních (intrinsic) faktorů. Vnější faktory si ES buňky částečně
syntetizují samy, ale ve větší míře musí být dodávány. Významným zdrojem těchto
faktorů je výživná vrstva na které se ES buňky kultivují = FEEDER. Vnitřní faktory
si ES buňky nesou jako pozůstatek svého embryonálního původu.
FEEDERFEEDER
- výživná vrstva = zdroj růstových faktorů (cytokiny, ECM, ..) a vhodný podklad
- nejčastěji se používají myší embryonální fibroblasty (13d p.c., MEF (PEF))- nejčastěji se používají myší embryonální fibroblasty (13d p.c., MEF (PEF))
- bez ,,feederu" z MEF = definované podmínky, ale horší ES buňky
- tendence používat druhově identické MEF = sníženi rizika přenosu virů, ...
- MEF lze nahradit i jinými typy fibroblastů případně jinými buňkami- MEF lze nahradit i jinými typy fibroblastů případně jinými buňkami
- MEF lze částečně nahradit komponenty ECM, specifickými cytokiny a přídavky,
matrigelem,..., obecně definovanějšími preparátymatrigelem,..., obecně definovanějšími preparáty
Důlëžitou komponentou kultivačního média pro ES jsou také nedefinované faktory séra,
které lze nahradit dodáváním specifických růstových faktorů. Často se také používákteré lze nahradit dodáváním specifických růstových faktorů. Často se také používá
tzv. Serum-replacement = lépe definovaná náhražka séra (patentované složení).
Obecný model inhibice diferenciace ES buněk
- ES buňky spontáně diferencují, v kultuře je třeba této diferenciaci zabránit
- diferenciace je často spojena s apoptózou- diferenciace je často spojena s apoptózou
- vhodnými kultivačními podmínkami, lze diferenciaci inhibovat
- faktory inhibující diferenciaci ES buněk se částečně liší u různých druhů,
ale existují výjimky i v rámci jednoho druhu!ale existují výjimky i v rámci jednoho druhu!
ES
cell
auto- a parakrinně působící factory
mezoderm
+ ektoderm
A B
+
entoderm
ektoderm
feeder
(výživná vrstva)
Model inhibice diferenciace myších ES buněk
ES
cell
FGF-4, Wnt
cell
mezoderm LIF* BMP-4mezoderm
+
entoderm
ektoderm
LIF* BMP-4
(BMP-2
/BMP-12
/FCS nebo SR*)/FCS nebo SR*)
- existují i linie mES buněk nezávislé na LIF
- zdá se, že z LIF závislé linie, lze vyselektovat LIF nezávislou (!?)
Feeder*
- zdá se, že z LIF závislé linie, lze vyselektovat LIF nezávislou (!?)
- mES buňky pěstované bez ,,feederu" ztrácí schopnost tvořit chiméry in vivo
- některé linie nelze bez ,,feederu" pěstovat vůbec
vlastnosti mES buněk jsou ovlivněny genotypem imbredního kmene myší
z kterého byly izolovány!
LIF ­ leukemia inhibitory factor
BMP-2,4,12 bone morphogenetic protein 2,4,12
FCS ­ fetal calf serum
FGF-4 ­ fibroblast growth factor
SR ­ serum replacement
*ABSOLUTNÍ OPTIMUM
Boiani & Scholer 2005
Model inhibice diferenciace lidských ES buněk
ES
cell
?, Wnt, FGF-2, IGF
cell
mezoderm FGF-2 Activin/Nodal
?
mezoderm
+
entoderm
ektoderm
FGF-2 Activin/Nodal
Noggin
Wnt
FCS?
+
FCS?
+
MEF (feeder) nebo matrigel
FCS ­ obsahuje jak difereciaci indukující, tak diferenciaci inhibující faktory. Kvalitu
FCS také ovlivňuje titr protilátek a složek koplementu. FCS se liší mezi jednotlivými
šaržemi = je třeba je testovat. Lépe je používat náhrady FCS se sníženoušaržemi = je třeba je testovat. Lépe je používat náhrady FCS se sníženou
koncentrací negativně působících látek na kultivaci ES buněk, např. SerumReplacement
( fy. Invitrogene-Gibco)Replacement ( fy. Invitrogene-Gibco)
OPTIMUM???
Vnitřní faktory charakterizující / regulující ES buňky
(pluripotentní embryonální buňky)(pluripotentní embryonální buňky)
Oct-4 (Oct-3/4, Oct-3, Pou5f1 ­ master of pluripotency)
- transkripční faktor, homeoprotein- transkripční faktor, homeoprotein
- exprimuje se již u 2/4 (myš ­ aktivace transkripce) buněčného embrya
- ve stádiu blastuly je jeho exprese výrazně zvýšena
- ve stádiu blastocysty je pouze v buňkách ICM- ve stádiu blastocysty je pouze v buňkách ICM
- později jeho exprese vymizí, zachovává se pouze v PGC (a později v zárodečných
buňkách), nízká exprese se předpokládá i v somatických kmenových buňkách ?!?
- nebyl nalezen u kuřat- nebyl nalezen u kuřat
- reguluje expresi FGF-4 (Oct-4/Sox-2), PDGF, ....
- v průběhu diferenciace za snížení jeho exprese odpovídá GCNF( germ cell nuclear
factor, RA (retinoic acid),...factor, RA (retinoic acid),...
- V primitivním ektodermu je exprese Oct-4 podporována LRH-1 (liver receptor
homologue 1)
NanogNanog
- transkripční faktor, homeoprotein
- jeho exprese vede k udržení vysoké hladiny Oct-4
- objevuje se již ve vnitřních buňkách moruly- objevuje se již ve vnitřních buňkách moruly
Sox-2
- Transkripční faktor Sry-rodiny (sex-determining region Y protein)- Transkripční faktor Sry-rodiny (sex-determining region Y protein)
- Kooperuje s Oct-4 na vlastní expresi
- V průběhu indukce neurální diferenciace se jeho exprese zvyšuje
Regulace transkripce faktory Oct-4, Nanog a Sox-2
Předpokládaný model vzájemné regulace exprese FoxD3,
Nanog a Oct-4 u mES. FOxD3 není exprimován u hES.
Pan2006Vzájemná regulace Oct-4 a Nanog není dosud plně objasněna.
Je však již jasné, že Oct-4 řídí transkripci Nanog přímou vazbou
v jeho promotoru (společně se Sox-2), jak u mES tak hES.
Pro self-renewal ES buněk je klíčové zachovat rovnováhu
v hladinách Oct-4 a Nanog (viz. výše).
Promotorové sekvence
rozpoznávané Oct-4, Nanog
a Sox-2 u hES.a Sox-2 u hES.
Model vzájemné regulace Oct-4, Nanog a Sox-2 a některé
jimi řízené geny u hES.jimi řízené geny u hES.
Promotory genů
Proteiny
Boyer2005
Promotory genů
Ztráta pluripotence u ES buněk v důsledku
deregulace rovnováhy mezi hladinou Oct-4 a Nanog
Chamber, 2004
Johnson 2006
ES BUŇKY
a) myší ES (mES) x b) lidské ES (hES)
(LIF / gp130* / STAT3 dependent) (LIF / gp130* / STAT3 independent)
Toto rozdělení je pravděpodobně dáno možností některých živočišných druhů mít
skrytou březost ve stádiu blastocysty (embryonální diapauza).
Rao, 2004
Signální dráha gp130 ->-> STAT3 ve vztahu k pluripotentním buňkám u člověka a myši
mESC PGC (h/m) EGC (h/m)mESC EGC (h/m)
embryonální diapauza (myš / lasicovití)
gp130 signalling
dependenthESC/mEpiSC
embryonální diapauza (myš / lasicovití)
somatické SC ??
pluripotent multipotent a méně
mouse
Signální dráha TGF / BMPs
+ mES
- hES / mEpiSC
- mES
+ hES / mEpiSC
Některé charakteristické znaky myších a lidských ES buněk
Glykolipidy, § Keratan chondroitin sulfátGlykolipidy, § Keratan chondroitin sulfát
proteoglycan, ITetraspannin transmembránové
proteiny, AP ­ alkalická fosfatáza,
EB ­ embryoidní tělísko, ESC ­ embryonálníEB ­ embryoidní tělísko, ESC ­ embryonální
kmenové buňky, SSEA ­ vývojově specifický
embryonální antigen (stage-specific embryonic
antigen), TRA ­ antigen odmítnutí nádoru
(tumor-rejection antigen), NR ­ nestudováno(tumor-rejection antigen), NR ­ nestudováno
(not reported)
Kmenové buňky epiblastu ­ EpiSC (Epiblast stem cell)Kmenové buňky epiblastu ­ EpiSC (Epiblast stem cell)
Brons, 2007 & Tesar, 2007
EpiSC
- neintegrují se do moruly a blastocysty => rozdíl s mES
- netvoří kompletní chiméry- netvoří kompletní chiméry
- nebyla detekována aktivní alkalická fosfatáza (AP)
(mES, hES, EC, EG, PGC, mají aktivní AP)
- EpiSC částečně vysvětlují rozdíly mezi mES a hES- EpiSC částečně vysvětlují rozdíly mezi mES a hES
Kmenové buňky epiblastu ­ EpiSC (Epiblast stem cell)
Brons, 2007 & Tesar, 2007
Kmenové buňky epiblastu ­ EpiSC (Epiblast stem cell)
Brons, 2007 & Tesar, 2007
Epigenetika ES buněk
Metylace DNA a kondenzace chromatinu u ES buněk
Meshorer & Misteli 2006
Profil metylace DNA u různých typů buněk (40 genů, 49 CpG míst)
Bibikova, 2006
cancer cells differ. cell SSC hES
Změny v distribuci HP1 a TIF1 v průběhu indukce
diferenciace embryonal. pluripotent. buněk (EC P19)
V průběhu diferenciace pluripotentních buněk dochází ke kondenzaci chromatinu,
což je možno detekovat i v podobě výraznejších/kondenzovanějších chromocenter
(DAPI-modře kontrastovaná DNA) a akumulací s chromatinem asociovaných proteinů(DAPI-modře kontrastovaná DNA) a akumulací s chromatinem asociovaných proteinů
(jako zde ukázaný TIF1 a HP1 proteiny)
do těchto oblastí. Současně dochází
také ke specifické asociaci mezi
jednotlivými typy HP1 proteinůjednotlivými typy HP1 proteinů
spojených s konkrétními diferenciačními
drahami.
CONTROL ­ nediferencované buňkyCONTROL ­ nediferencované buňky
S-R a SF-R ­ různé typy diferenciací
TSA ­ inhib. Acetyltransferáz
5dAzaC ­ inhibitor metyltransferáz
Bártová, 20007
Model změn trankripčního profilu v průběhu indukce diferenciace ES buněk
HA ­ model postupné (hierarchické) aktivace (hierarchical activation) ­> metylace DNA
ETCM ­ model povolené/umožněné transkripce (early transcription competence marks)
­> modifikace histonů
Meshorer & Misteli 2006
­> modifikace histonů
PT ­ model promiskuitní transkripce (promiscuous transcription)
­> kombinace transkripčních faktorů a transdukce signálu
Modifikace histonů ­ regulace transkripce
Profil postranslačních modifikací (lysinových zbytků) histonů H3 a H4
u ES (J1, V6.5), EC a MEF buněku ES (J1, V6.5), EC a MEF buněk
Dai & Rasmussen 2007
Změny histonových modifikací po působení TSA* u ES a MEF buněk
Dai & Rasmussen 2007
*TSA ­ Trichostatin: inhibitor deacetyláz
Polycomb group (PcG) x Trithorax group (trxG) proteins
PcG jsou odpovědné za inaktivaci transkripce cílových oblastí
trxG jsou odpovědné za aktivaci transkripce cílových oblastí
- obecně patří mezi skupinu proteinů modifikujících chromatin
- regulují zejména transkripci homeotických genů ­ význam v ontogenezi
- jsou odpovědné za epigenetickou pamět genomu
- rozpoznávají specifické a vzájemně málo homologní skvence DNA- rozpoznávají specifické a vzájemně málo homologní skvence DNA
PRE ­ PcG responsive element
TRE ­ trxG response element
- jedná se o proteinové komplexy se základní jednotnou strukturou- jedná se o proteinové komplexy se základní jednotnou strukturou
(PcG 4 základní skupiny komplexů), specifita těchto komplexů
k daným PRE/TRE je dána dalšími asociujícími specifickými podjednotkami
Proliferace ES buněk
S laskavým nedovolením z katalogu Santa Cruz Biotechnology, Inc.
- ES buňky relativně intenzivně proliferují (podobné nádorovým buňkám)
- G1 fáze buněčného cyklu je krátká (u mES ~ 1.5 h), zdá se, že chybí G1-checkpoint*
- velké procento buněk je v S fázi buněčného cyklu (mES > 60%, hES > 50%)
- doubling time mES ~ 12h, hES ~ 24h
- specifická charakteristika regulace buněčného cyklu (odolnost k p16,- specifická charakteristika regulace buněčného cyklu (odolnost k p16,
nízká hladina cyklinů D, vysoká hladina cyklinu E, není potřeba proteinů rodiny Rb)
- inhibice proliferace (suboptimální podmíky) vede k diferenciaci a apoptóse,- inhibice proliferace (suboptimální podmíky) vede k diferenciaci a apoptóse,
diferenciace a apoptósa ES buněk, však nemusí vést ke snížení proliferace jako takové
*tzv. kontrolní bod R, o průchodu tímto bodem rozhodují zejména mechanismy rozpoznávající*tzv. kontrolní bod R, o průchodu tímto bodem rozhodují zejména mechanismy rozpoznávající
itegritu/neporušenost genomu, buňky s požkozenou DNA jsou za normálních okolností v tomto bodě
zastaveny. Porucha tohoto kontrolního mechanismu je typická pro nádorové buňky.
Jak vypadá správná ES buňka?
Jsou všechny ES buňky v kultuře stejné?Jsou všechny ES buňky v kultuře stejné?
LIF -> STAT3 aktivita u mES buněkLIF -> STAT3 aktivita u mES buněk
Microarray analýza exprese ,,stemness" genůMicroarray analýza exprese ,,stemness" genů
Davey, 2006
Fortunel, 2003
pokračování
pokračování
Model narůstající heterogenity v rostoucí kolonii ES buněk
za dodržení známých optimálních kultivačních podmínekza dodržení známých optimálních kultivačních podmínek
Myší ES
růst kolonie ES buněk
30<* 50<* 100<*
Lidské ES
Buňky odpovídající buňkám ICM/epiblastu
Lidské ES
Buňky odpovídající buňkám ICM/epiblastu
Časného neuroektodermu
Buňky primitivního entodermu
(morphologicky navíc tvoří také malá granula)
vývoj blastocysty
(morphologicky navíc tvoří také malá granula)
*orientační počet buněk v kolonii
epiblastICM
blastocoel blastocoel
vývoj blastocysty
*orientační počet buněk v kolonii blastocoel blastocoel
trofoectoderm
Variabilita v analýze transkripčního profilu u ES buněk (ESC), neurálních progenitorů (NPC),
progenitorů retiny (RPC) a hematopoetických kmenových buněk (HSC) u myši.
Tři pracovní skupiny, jedna metoda.
674356
ESC x NPC + RPC/HSC
ESC
Tři pracovní skupiny, jedna metoda.
674356
223
1 475 204
ESC x NPC + RPC/HSC
ESC
1389275
2
6
23
1 475
332
343
204
637
201
343637
286798 Ramalho-Santos
Fortunel
ESC + NPCNPC 286
30157
798
54 267
Ivanova ESC + NPCNPC
10
58 685
30157
1744337
238
54 267
1341 792
Fortunel, 2003
58 685792
mES je možno reverzibilně převést na buňky připomínající buňky primitivního ektodermu
tzv. EPL (early-primitive ectoderm-like) buňky. Tyto buňky již nemjí podobně jako buňkytzv. EPL (early-primitive ectoderm-like) buňky. Tyto buňky již nemjí podobně jako buňky
primitivního ektodrmu schopnost tvořit buňky parietálního entodermu. Také některé jejich
další schopnosti diferencovat, jsou oproti ES buňkám pozměněny (Pelton 2002) .
+LIF
- LIF + HepG2 buňkami kondiciované médium
EPL
(+ FGF-5*)
ES
(- FGF-5*)
+LIF
Gadue 2005
*EPL buňky jsou podobně jako buňky primitivního ektodermu exprimují FGF-5 na rozdíl od ES buněk,
které exprimují zejména FGF-4 (platí pro myš)
VYUŽITÍ ES BUNĚKVYUŽITÍ ES BUNĚK
1. Biologický a biomedicínský výzkum
- Příprava geneticky modifikovaných organismů
- Studium mechanismů časné embryogeneze / diferenciace
- Studium mechanismů kancerogeneze- Studium mechanismů kancerogeneze
- Studium embryotoxicity
- Testování farmak
2. Lékařství
- Buněčné a tkáňové terapie- Buněčné a tkáňové terapie
- Příprava biologicky aktivních preparátů
- Nosiče biologicky aktivních látek (pathotaxe)
Příprava geneticky modifikovaných organismů - GMO
Pro vytvoření linie GMO je potřeba, aby požadovaná genetická modifikace byly obsažena
i v pohlavních buňkách. Tuto modifikaci je tedy potřeba provést na buňkách toti- nebo
Příprava geneticky modifikovaných organismů - GMO
i v pohlavních buňkách. Tuto modifikaci je tedy potřeba provést na buňkách toti- nebo
pluripotentních.
* Náhodným nebo cíleným(?) vložením požadované DNA do zygotyˇ Náhodným nebo cíleným(?) vložením požadované DNA do zygoty
* Náhodným nebo cíleným vložením požadované DNA do ES buněk
- Díky prakticky neomezené možnosti kultivace ES buněk, lze mít prováděnou genetickou
modifikace plně pod kontrolou, a také ji můžeme velice přesně naplánovat!!!modifikace plně pod kontrolou, a také ji můžeme velice přesně naplánovat!!!
- ES buňky jsou pluripotentní, po zpětné injikaci do blastocysty a vložení této blastocysty
do dělohy pseudo-pregnantní myši, blastocysta pokračuje ve vývoji a vzniklý jedinec je
chimérou buněk původni ICM a injikovaných ES na ůrovni všech tkání, tedy i zárodečné.chimérou buněk původni ICM a injikovaných ES na ůrovni všech tkání, tedy i zárodečné.chimérou buněk původni ICM a injikovaných ES na ůrovni všech tkání, tedy i zárodečné.chimérou buněk původni ICM a injikovaných ES na ůrovni všech tkání, tedy i zárodečné.
Diferenciace ES buněkDiferenciace ES buněk
a) In vivoa) In vivo
- teratomy: injikace suspenze ES buněk do vaskularizované tkáně
imunitně tolerantního zvířete, popřípadě do zvířete s
farmakologicky potlačenou imunitní odpovědífarmakologicky potlačenou imunitní odpovědí
- chiméry: injikace ES buněk do blastocysty, navrácení takové
blastocysty do pseudo-pregnantní myši = vznik chimerického
jedincejedince
b) In vitro
- metodiky korespondující s ontogenezí
- metodiky získané empiricky (kopírující ontogenezi?)- metodiky získané empiricky (kopírující ontogenezi?)
Musí buňka diferencující z ES buňky vždy kopírovat ontogenezi aby dosáhla určitého stavu?Musí buňka diferencující z ES buňky vždy kopírovat ontogenezi aby dosáhla určitého stavu?
In vitro diferenciace ES buněk
kultivace
selekceindukce selekceindukce
a) Embryoidní tělíska (Embryoid bodies
- EB)- EB)
+jednoduché, více buněčných typů
+ tolerující genotyp
- špatně definované podmínky- špatně definované podmínky
b) V monovrstvě
Rathjen 1998 / Bílek 2004
b) V monovrstvě
+ dobře definovné podmínky
- malá výtěžnost- malá výtěžnost
- silně závislé na genotypu
Úloha specifických růstových faktorů v ontogenezi myši
Loebel, 2003
Příklady diferenciace myších ES buněkPříklady diferenciace myších ES buněk
kombinací typu jejich kultivace
a specifických růstových faktorů
s porovnáním úlohy těchto faktorůs porovnáním úlohy těchto faktorů
v myší ontogenezi
pokračovánípokračování
Loebel, 2003
Guasch, 2005
Příklad účinků jednotlivých specifických růstových faktorů na indukci diferenciacePříklad účinků jednotlivých specifických růstových faktorů na indukci diferenciace
u lidských ES buněk v kombinaci s tvorbou embryoidních tělísek
Schuldiner, 2000
Model regenerace poškozené hematopoesy v důsledku Rag2-/- mutace
s použitím ES buněk, genetických manipulací a jaderného reprogramovánís použitím ES buněk, genetických manipulací a jaderného reprogramování
Rideout, 2002
SOUČASNÉ PROBLÉMY S VYUŽITÍM ES BUNĚK V TERAPIISOUČASNÉ PROBLÉMY S VYUŽITÍM ES BUNĚK V TERAPII
- hES se nedaří dlouhodobě kultivovat beze změn v genotypu- hES se nedaří dlouhodobě kultivovat beze změn v genotypu
- dlouhodobá kultivace za suboptimálních podmínek vede k dosud neznámým,
epigenetickým změnám snižujícím schopnost pluripotence (ireverzibilními iepigenetickým změnám snižujícím schopnost pluripotence (ireverzibilními i
pro cytoplasmu zygoty, Amano 2006)
- dosud není spolehlivě vyřešen potencionální vznik teratomů- dosud není spolehlivě vyřešen potencionální vznik teratomů
- biologie a diferenciační potenciál ES buněk nejsou dosud dobře
prozkoumányprozkoumány
- kultivace ES buněk je stále závislá na nedefinovaných faktorech
- etika získávání nových lidských ES linií
- finance, přes velice atraktivní potenciál, který v sobě ES buňky mají, není jisté, jestli
současná společnost bude mít dost prostředků na jejich využití např. v buněčné terapii
Chromosomální stabilita a ES buňky
Draper, 2004; Hanson, 2005
- dlouhodobá kultivace ES buněk vede k selekci odolnejších klonů a subpopulací
- menší responzivnost na vnější signály, rychlejší proliferace, menší nároky
na kultivaci, klíčové znaky často zachovány (Oct-4, Nanog, příslušné SSEA,...)
- u myší snížena schopnost tvorby chimér a zéjména germline u těchto chimér
- často spojeno s genetickou manipulací (knock-out, -in ES linie)- často spojeno s genetickou manipulací (knock-out, -in ES linie)
- nestabilita chromosómů, polyploidie, trizomie, zlomy a přeskupování genů
=> adaptace na in vitro podmínky
- hES, primární je trizomie chromozomu 12 nebo 17, vzácněji chromosomu 14 a 20- hES, primární je trizomie chromozomu 12 nebo 17, vzácněji chromosomu 14 a 20
- často dochází i ke zdvojení dlouhého raménka chromosomu 17 a k translokaci
této kopie na dlouhé raménko chromosomu 6 => posílení exprese genůtéto kopie na dlouhé raménko chromosomu 6 => posílení exprese genů
na chromosomu 17 (Survivin ­ proti apoptóse, STAT3 ­ self-renewal mES a nadbytek
u většiny nádorů, GRB2 a 7 (growth factor receptor bound protein, viz. signální transdukce))
- na chromosomu 12 je lokalizován nanog (Nanog)
- časté i změny malých oblastí na chromosomech 1, 8, 18 a 20
- u mES se jedná o změny zejména chromosomů 8 a 11- u mES se jedná o změny zejména chromosomů 8 a 11
(myší chromosom 11 je z části ekvivalentní k lidskému chromosomu 17)
Apoptická kontrola nestability kariotypu a ES buňky
Checkpoint-apoptosis.... of karyotipic instability. Mantel, 2007Checkpoint-apoptosis.... of karyotipic instability. Mantel, 2007
- u zdravých somatických buněk při poruchách mitotického aparátu během jejich dělení
a tak vznikající chyby v mitóse vedou k jejich přechodu do senescentního stavua tak vznikající chyby v mitóse vedou k jejich přechodu do senescentního stavu
nebo k indukci apoptósy
- ES buňky mají zvýšenou toleranci k poruchám mitózy, menší citlivost tzv. SAC
(SAC ­ splindle assembly checkpoint)
=> akumulace aneuploidních
a polyploidních buněk v populacia polyploidních buněk v populaci
- indukcí diferenciace lze tyto buňky
částečně eliminovat (apoptósa)částečně eliminovat (apoptósa)
- tetraploidní buňky (blastomery)
mohou tvořit jen trofoblast
=> G1 MTA/tetraploidity checkpoint1
=> využití při tvorbě embryí plně ES
původu
Příklad nárůstu apoptósy s diferenciací a požkozeným mitotickým aparátem
ES ­ embryonální kmenové buňky
EB ­ ES diferencovanou formou embryoidních tělísek
Noc/NOC ­ nocodazol
PAC - paclitaxelPAC - paclitaxel
Primordiální zárodečné buňky ­ PGC
(primordial germ cell)(primordial germ cell)
- PGC se u myši objevují již 6 dpc, pravděpodobně je jejich vznik indukovaný v průběhu- PGC se u myši objevují již 6 dpc, pravděpodobně je jejich vznik indukovaný v průběhu
gastrulace, a to vnějšími signály, zejména BMP (na rozdíl od žab, Drosophily a C. elegans).
- 6 ­ 7.5 dpc migrují vně vlastní embryo, později (8.5 dpc <) migrují podél zadního střeva
embrya do vytvořené zárodečné lišty.embrya do vytvořené zárodečné lišty.
- PGC zanikají po usazení v zárodečné liště (10-13 dpc u myši), stávají se z nich
zárodečné buňky. Prodělají ještě 2-3 mitózy a u samců vznikají prospermatogonie
zastavené v G0/G1 fázi mitózy. U samic vstupují do meiotické profáze (obojí > 12.5 dpc).
- Podobně jako ICM a ES buňky mají vysokou hladinu alkalické fosfatázy (ale TNAP ne- Podobně jako ICM a ES buňky mají vysokou hladinu alkalické fosfatázy (ale TNAP ne
GCAP/TNAP), Oct4, Nanog, ..
- Významné jsou zdá se zejména Stella a Fragilis.
- PGC nejsou pluripotentní!- PGC nejsou pluripotentní!
- PGC mají omezený počet dělení, u myši napočítáno kolem 1000 buněk, rozdíly v závislosti
na imbrední lini
Stella
Také u buněk ES a epiblastu, později jen u PGC, podílí se na udržení jejich fenotypu,
po jejich usazení v zárodečné liště jeho exprese vymizí.po jejich usazení v zárodečné liště jeho exprese vymizí.
Fragilis
Z rodiny IFN indukovaných genů, je silně exprimován při formování PGC, s jejichZ rodiny IFN indukovaných genů, je silně exprimován při formování PGC, s jejich
migrací jeho exprese klesá.
Cyklus zárodečných buněk u myši
PGCPGC
primordiální zárodečné buňky
Exprese Fragilis mezi 6 ­ 7 dpc
Exprese Oct-4 v PGCExprese Oct-4 v PGC
usazených v zárodečné liště
Mechanismus vzniku PGC
Hayashi, 2007
Hayashi, 2007
Embryonální zárodečné buňky ­ EGC
(Embryonic germ cells)
- EGC jsou odvozeny z primordiálních zárodečných buněk (PGC ­ primordial germ cell).- EGC jsou odvozeny z primordiálních zárodečných buněk (PGC ­ primordial germ cell).
- Podobně jako ES buňky je lze expandovat in vitro, a jsou pluripotentní, jak dokazuje jejich
schopnost diferencovat do buněk všech tří zárodečných listů jak in vitro (EB), tak in vivoschopnost diferencovat do buněk všech tří zárodečných listů jak in vitro (EB), tak in vivo
(chiméry a teratomy).
- Z epigenetického pohledu (DNA metylace) jsou však více podobné PGC než ES buňkám
- Rozdíly v metylaci DNA se týkají zejména imprintovaných genů v závislosti na pohlaví,
u EGC izolovaných z pozdějších embryonálních stádií se tento rozdíl zmenšuje.
Tyto ,,imprinting-free" PGC, však již netvoří zdravé chimerické jedince.Tyto ,,imprinting-free" PGC, však již netvoří zdravé chimerické jedince.
- U myší lze EGC izolovat z PGC mezi 8.5 ­ 12.5 dpc, později to již nelze
- PGC a následně EGC lze izolovat in vitro z ES buněk (lidských i myších)- PGC a následně EGC lze izolovat in vitro z ES buněk (lidských i myších)
- m/hEGC jsou závislé na LIF, během časné kultivace i na FGF2 a Stem cell faktoru (SCF)
(+ feeder & FCS/SR).(+ feeder & FCS/SR).
- Exprimují podobné markery jako ES buňky, lidské EGC jsou fenotypem více podobné
mES než hES (morfologie + exprese SSEA-1!; u hES se SSEA-1 exprimuje až s jejich diferenciací)mES než hES (morfologie + exprese SSEA-1!; u hES se SSEA-1 exprimuje až s jejich diferenciací)
Vztahy mezi pluripotentními buňkami a některé klíčové regulační komponenty
těchto buněk
Sl ­ Steel locus, Ter ­ Teratoma locus, pgct1 ­ primordial germ cell tumor susceptibility locus, PTEN Phosphatase
and tensin homologue deleted on chromosome 10, mTR (mTOR) - serine-threonine kinase
Donovan, 2003
Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10, mTR (mTOR) - serine-threonine kinase
mammalian target of rapamycin
Schema předpokládaného zapojení FGF, LIF a KL (c-Kit ligand = Steel factor (SF)/
stem cell factor (SCF) v regulaci sel-renewal EG buněkstem cell factor (SCF) v regulaci sel-renewal EG buněk
Donovan, 2003
Není původ ES buněk v PGC ???
Zwaka, 2005
Není původ ES buněk v PGC ???
Zwaka, 2005
M- myš; H ­člověk; N/D ­ netestováno; ES ­ embryonální kmenové buňky; EGC ­ časné primordiální
zárodečné buňky (!); LGC ­ pozdní primordiální zárodečné buňky; ICM ­ vnitřní buněčná masa;
PE ­ primitivní ecdoderm/epiblast
Zwaka, 2005
Kmenové buňky teratomu / teratokarcinomu - ECCKmenové buňky teratomu / teratokarcinomu - ECC
Embryonální nádorové buňky (Embryonal carcinoma cells)
- Izolované rozkultivováním a klonální selekcí buněk teratomu / teratokarcinomu
- Lidské spontálně, myší indukované transplantací časných embryonálních buněk
do dobře vyživované tkáně (varlata, ledviná kapsa, břišní dutina,...), musí býtdo dobře vyživované tkáně (varlata, ledviná kapsa, břišní dutina,...), musí být
imunotolerance
- Podobné vlastnosti jako ES buňky, ale méně závislé na specifických růstových- Podobné vlastnosti jako ES buňky, ale méně závislé na specifických růstových
faktorech (+)
- Tvoří také chiméry, ale nedokonalé, většinou hynou v průběhu embryogeneze (-)
- Většinou snížená schopnost pluripotence jak in vivo, tak in vitro (-)- Většinou snížená schopnost pluripotence jak in vivo, tak in vitro (-)
- Obecně nestabilní genotyp a časté aneuploidie (-)
- Modelové studie genetické nestability a diferenciace, vzniku teratomů- Modelové studie genetické nestability a diferenciace, vzniku teratomů
- Levnější alternativa k ES buňkám, lepší stabilita v experimentálních systémech jak ES (+)
Kmenové buňky extraembryonálních tkání
A) Kmenové buňky trofektodermu (trofoblastu)
FGF-dependent (FGF4, FGFR2); Cdx2, Eomes, Err
B) Kmenové buňky primitivního entodermu (hypoblastu)
XEN ­ buňky extraembryonálního entodermu
primitivní ektoderm
zárodečný epiblast / embryoblast
allantois
amnion
blastomery
ICM
primitivní entoderm
primitivní ektoderm amnion
mezoderm žloutkového vaku
viscerální entoderm
blastomery
trofektoderm linie trofoblastu
parietální entoderm