Somatické kmenové buňky ­ SSCs (Somatic stem cells) - Podílejí se na regeneraci tkání, orgánů a homeostázi obecně- Podílejí se na regeneraci tkání, orgánů a homeostázi obecně - Mnohé jsou minimálně multipotentní - Kromě profesionálních SSC, existuje i množství fakultativních typů - Případná pluripotence nebyla dosud prokázána- Případná pluripotence nebyla dosud prokázána Jak vypadají, jaké mají vlastnosti a schopnosti ? Mají adultní SSCs stejný potenciál jako embryonální SSCs? Jsou všechny stejné, podobné, tkáňově specifické ? Lze je kultivovat in vitro ?Lze je kultivovat in vitro ? Kde se nacházejí? Jsou nesmrtelné? ,,Existují?",,Existují?" ADULTNÍ x EMBRYONÁLNÍ somatické kmenové buňky Embryonální somatické kmenové buňky somatické kmenové buňky Embryonální somatické kmenové buňky - Během embryogeneze dávají vznik tkáním a orgánům - Případná pluripotence nebyla dosud prokázána - Během časné embryogeneze se intenzivně dělí, později již méně (???)- Během časné embryogeneze se intenzivně dělí, později již méně (???) - Lze je izolovat a množit in vitro (zatím pouze po omezenou dobu) - Pravděpodobně jsou schopné transdiferenciace (?) - Tvoří solidní nádory (možná i teratomy?!?) po injikaci do imunitně tolerantního organismu (všechny ??) - Ačkoliv jsou v mnoha ohledech podobné somatickým kmenovým buňkám z dospělého organismu (mnohé znaky, podmínky kultivace a izolace), je již jasné, že stejné nejsou.kultivace a izolace), je již jasné, že stejné nejsou. Původ SSC Biologie SSC kmenové buňky (aktuální) potenciální kmenové buňky přechodně se dělící progenitory funkční terminálně diferencované buňky(aktuální) kmenové buňky diferencované buňky přechodně se dělící buňky ­ TA (transiently amplifying) Odhad generačních cyklů od kmenové buňky po funkční / terminálně diferencovanouOdhad generačních cyklů od kmenové buňky po funkční / terminálně diferencovanou buňku pro různé typy tkání u myši ASYMETRICKÉ DĚLENÍ BUNĚK O symetrii dělení rozhodujeO symetrii dělení rozhoduje - orientace dělícího aparátu (vřeténka) - polarizace buněk v tkáni- polarizace buněk v tkáni - gradienty v buňce - ... Huttner 2005 Haydar 2002 Příklady mechanismů regulujících symetrii buněčného dělení na modelovýchsymetrii buněčného dělení na modelových orgaismech NB ­ neuroblast SOP ­ sensory organ progenitor (Jan & Jan 2000; Robert Andrews & Julie Ahringer 2007) Proporční změny v symetrii buněčného dělení mezi neurálními kmenovými buňkami (stem) a neurálními progenitory (neurogenic, transientně se dělícími buňkami ­ TA)a neurálními progenitory (neurogenic, transientně se dělícími buňkami ­ TA) v půběhu neurogeneze u myši Haydar 2002 Dělení genomu u progenitorů/kmenových buněk při asymetrickém dělení Conboy 2007 Četnost asymetricky a symetricky dělících se kmenových buněk kosterní svaloviny in vitro - potvrzení výše uvedené hypotézy- potvrzení výše uvedené hypotézy Sca-1 ­ znak kmenové buňky koserní svaloviny Desmin ­ protein charakterizující myoblastDesmin ­ protein charakterizující myoblast Conboy 2007 NICHE a jak být profesionální kmenovou buňkou Stejně jako je v současnosti obtížné fyzicky uchopit jednotlivou SSC je velice těžké poznat, jak vypadá a jaké vlastnosti má prostředí, kde se SSCs nachází = niche. Profesionální SSCs mají tzv. nezralý fenotyp, tj. připomínají buňky značně časných vývojových stádiímají tzv. nezralý fenotyp, tj. připomínají buňky značně časných vývojových stádií (z hlediska vývoje organismu / ontogeneze). Předpokládá se, že v závislosti na potřebách organismu buď vůbec neproliferují nebo jen pomalu. Intenzivnější proliferace se předpokládá v odpověď na poranění dané tkáně případně její jinou nedostatečnost. Tato proliferace, v odpověď na poranění, je in vivo u některých tkání, např. nervové, značně nedostatečná a tkáň má tak velice malou schopnost regenerace, na rozdíl např. od epitelů.nedostatečná a tkáň má tak velice malou schopnost regenerace, na rozdíl např. od epitelů. Pro mES je ,,niche" feeder + LIF + nedefinované faktory séra (BMP není plně dostatečné z dlouhodobého hlediska). Je to jediný ,,dokonalý" niche který umíme navodit v in vitro podmínkách, paradoxně u kmenových buněk, které přirozeně neexistují. In vitro,v in vitro podmínkách, paradoxně u kmenových buněk, které přirozeně neexistují. In vitro, však při vhodné manipulaci a za dodržení výše uvedených podmínek mES představují nejhomogenější a ve vlastnostech i nejstálejší populaci kmenových buněk (2007 :o)).nejhomogenější a ve vlastnostech i nejstálejší populaci kmenových buněk (2007 :o)). Zánik niche = zánik/diferenciace kmenové buňky. Opačný proces, navození niche (kdyby jsme ho znali) kolem progenitoru nebo terminálně diferencované buňky nevede ke vzniku buňky kmenové (analogicky k pokusům s ES a dalšími o SSCs ,,obohacenými" populacemibuňky kmenové (analogicky k pokusům s ES a dalšími o SSCs ,,obohacenými" populacemi SSCs. Je to pravděpodobně v důsledku ireverzibilně (z pohledu možností extracelulárního působení) změněných regulací ,,intrinsic" faktorů, které si SSCs zachovávají z časných vývojových stádií ontogeneze. Toto dokazují i pokusy s exogeními expresemi takových faktorů v různých populacích dělících se buněk (viz. reprogramování buněk). Co v NICHE najdeme? růstové faktory, proteiny extracelulární matrix, povrchy buněk / buněčnýrůstové faktory, proteiny extracelulární matrix, povrchy buněk / buněčný kontakt, hypoxie, nedostatek živin? Podobně jako se zdají být SSCs tkáńově/orgánově specifické, budou specifické i jejich ,,niche".budou specifické i jejich ,,niche". Naveiras, 2006 Jak očekáváme, že profesionální SSCs vypadají - Měly by exprimovat ,,stemness" geny (které to ale jsou?), analogické geny s ES buňkami nebývají tak silně exprimovány, jak to známe právě u ES buněk, pravděpodobně tu hraje svou roli pluripotence ES buněk oproti multipotenci SSCs, kdy tzv. ,,stemness" geny ES buněk jsou spíše geny exprimované pluripotentnímikdy tzv. ,,stemness" geny ES buněk jsou spíše geny exprimované pluripotentními buňkami obecně. - Předpokládáme, že mají vysokou hladinu inhibitorů cyklin-dependentních kináz- Předpokládáme, že mají vysokou hladinu inhibitorů cyklin-dependentních kináz (p21waf1/cip1, p15INK4B, p16INK4A, p18INK4C) => pomalá proliferace / semi-quiescence. Toto je velký rozdíl k ES buňkám, které jsou take intenzivně proliferujícími, na rozdílToto je velký rozdíl k ES buňkám, které jsou take intenzivně proliferujícími, na rozdíl somatickým kmenovým buňkám v tkáních dospělého jedince. - Z ,,extrinsic" faktorů se předpokládá významná úloha drah TGF rodiny, Wnt, Notch,- Z ,,extrinsic" faktorů se předpokládá významná úloha drah TGF rodiny, Wnt, Notch, a gp130, v souvislosti s vlastnostmi ,,niche" pak také signalizace přes kadheriny a buněčné adhezivní molekuly (CAM ­ cell adhesion molecule) v jejichž signalizacia buněčné adhezivní molekuly (CAM ­ cell adhesion molecule) v jejichž signalizaci jsou MAPKs, -catenin, NFB,... - Jsou obecně odolné k toxinům (MDR - multidrug resistance proteins, ATP pumpy),- Jsou obecně odolné k toxinům (MDR - multidrug resistance proteins, ATP pumpy), ale i k tvrdému záření (paprsky X, -záření). SSC ,,mezodermálního" původu Mezenchymální kmenové buňky (MSCs - mesenchymal stem cells) Hematopoetické kmenové buňky (HSCs - hematopoietic stem cells)(MSCs - mesenchymal stem cells) (HSCs - hematopoietic stem cells) krevní elementy, +buňky tkání mezodermálního původu, krevní elementy, +buňky tkání mezodermálního původu, snad i krevní elementy, asi ne buňky ledvin, + Zdrojem adultních SSC mezodermálního původu je zejména kostní dřeň HSCs (krev, ? jaterní buňky, kardiomyocyty, ...?) Zdrojem adultních SSC mezodermálního původu je zejména kostní dřeň BMSSCs (chrupavka, kost, stroma kostní dřeně, vazivo, ?svaly, nervy,...?) MAPCs (??? pluripotent ???) Endoteliální kmenové buňkyEndoteliální kmenové buňky ?Něco dalšího ? Adultní multipotentní progenitorové buňky ­Adultní multipotentní progenitorové buňky MAPCs (multipotent adult progenitor cells) - ,,Jejich existence je velice kontroverzní"- ,,Jejich existence je velice kontroverzní" - propagátorkou je Catherine M. Verfaillie (Jiang, 2002) - MAPCs byly poprvé izolovány z kostní dřeně, později i z mozku a svalů- MAPCs byly poprvé izolovány z kostní dřeně, později i z mozku a svalů - na rozdíl od ostatních SSC jsou to proliferující buňky s vysokou aktivitou telomerázy - v kultuře lidských a krysích MAPCs nebyly nalezeny aneuploidie, u myší ano (u myší časté i pro jiné buňky včetně ES???)(u myší časté i pro jiné buňky včetně ES???) - v kultuře in vitro vyžadují ,,nízkou" denzitu (m, r 500-1000 b./cm2; h 1500-3000 b./cm2) - velmi náročná kultivace (fibronectin, EGF, PDGF, LIF, velké objemy pro obdržení dostatečného množství buněk pro analýzu)dostatečného množství buněk pro analýzu) - in vitro dávají vznik řadě typů buněk včetně neurálních, čistota diferencované kultury 70-80% - in vivo, po injikaci do blastocysty tvoří chiméry (schopné narození )- in vivo, po injikaci do blastocysty tvoří chiméry (schopné narození ) s chimerismem 1-40%, avšak schopnost tvořit zárodečné buňky nebo celé embryo (injikace do tetraploidního trofektodermu) nebyla prokázána - netvoří teratomy- netvoří teratomy - není jasná jejich existence in vivo - není známý specifický marker- není známý specifický marker Fenotyp MAPCs antigen exprese blízké SC Fenotyp MAPCs antigen exprese blízké SC MHC-I - MSC +++ CD44 (H-CAM) +/- různé buňky CD105 (endoglin) - MSC +++ CD34 (L-selectinR) - HSC +++ CD45 (tyr. fosfatáza) - HSC +++CD45 (tyr. fosfatáza) - HSC +++ cKit (CD117, SCFR) - HSC +++ Thy1 (CD90/CDw90) + HSC +++Thy1 (CD90/CDw90) + HSC +++ AC133h / Sca1*m + HSC +++ SSEA1 +m mES +++SSEA1 +m mES +++ Oct4 +m m+hES +++ Rex1 +m mES +++ negativní ,,-", ne vždy negativní ,,+/-", slabá ,,+", mírná ,,++", silná ,,+++" *Sca1 ­ stem cell antigen, GPI (glykosylfosfoinositolovou) kotvou vázaný*Sca1 ­ stem cell antigen, GPI (glykosylfosfoinositolovou) kotvou vázaný protein v cytoplasmatické membráně zejména ,,velice časných" progenitorů 40% chimerismus u myši s ROSA26* MAPCs mozek kůžeStanovení -galaktosidázové aktivity na sagitárním řezu u normální myši (i) a chimerické myši s ROSA26-MAPCs (j). mozek kůže koster. sval. srdce játra tenké střevo ledviny slezina * ROSA26 myši exprimují ve všech buňkách -galaktosidázu (transgení myši - GMO) Jiang,2002 Mezenchymální kmenové buňky ­ MSCs (mesenchymal stem cells)Mezenchymální kmenové buňky ­ MSCs (mesenchymal stem cells) Kmenové buňky kostní dřeně ­ BMSSCs (bone marow stroma stem cells)Kmenové buňky kostní dřeně ­ BMSSCs (bone marow stroma stem cells) Kmenové buňky svalové tkáně, chrupavky, kosti, .... Caplan, 2001Caplan, 2001 - MSC lze izolovat z mezenchymálních tkání (kostní dřeň, svaly, dermis, tuková tkáň, chrupavky, kosti, ale i z krevního oběhu (zde se někdy označují jako pericyty), zejména však z kostní dřeně. - Přesný fenotyp není znám, pracuje se se směsnou populací buněk, která po indukci příslušnými kombinacemi růstových faktorů je schopna dát vznik buňkám dané tkáně.příslušnými kombinacemi růstových faktorů je schopna dát vznik buňkám dané tkáně. - Na rozdíl od MAPCs exprimují proteiny MHC-1, a byly připraveny protilátky (SH2, SH3 a SH4) se zvýšenou afinitou k MSCs.a SH4) se zvýšenou afinitou k MSCs. - S věkem jich v organismu ubývá. - Jsou komerčně dostupné, jejich aplikace v medicíně je ve fázi klinických zkoušek. - Přes velkou snahu mnoha týmů, pluripotence nebo transdiferenciace v buňky jiného- Přes velkou snahu mnoha týmů, pluripotence nebo transdiferenciace v buňky jiného zárodečného listu nebyla dosud potvrzena. Mechanismus zapojení MSCs v regulaci homeostáze podpůrné/růstové faktory Mechanismus zapojení MSCs v regulaci homeostáze MSCs TKÁNĚ regenerace BIOAKTIVNÍ podpůrné/růstové faktory (TROPHIC) TKÁNĚ homeostáze BIOAKTIVNÍ FAKTORY imunosuprese Mechanismu nepřímého zapojení MSCs (a jejich derivátů?) do procesů regenerace jako lokálního zdroje růstových faktorůjako lokálního zdroje růstových faktorů MSCs se aplikují v případě - infarkt myokardu - reparace tkáně menisku - Crohnova nemoc (imunosuprese)- Crohnova nemoc (imunosuprese) Caplan,2006 Kmenové buňky stroma kostní dřeně ­ BMSSCs (bone marrow stroma stem cells) - nejasný fenotyp, ale snadno získatelné ve směsných populacích z kostní dřeně, jako buňky adherující na plastik pro tkáňové kultury (na rozdíl od buněk hematopoetických řad) - fibroblastům podobné buňky (a) větší, fibroblastům podobné a b) menší, zřejmě- fibroblastům podobné buňky (a) větší, fibroblastům podobné a b) menší, zřejmě progenitory) - MAPCs jsou někdy označovány jako podskupina (subset) BMSSCs (pluri- x multipotentní???), celkově se ale překrývají s MSCs, obecně je možné, že rozdíly(pluri- x multipotentní???), celkově se ale překrývají s MSCs, obecně je možné, že rozdíly mezi typy jsou dány spíše selekcí, způsobem izolace a nasměrováním k některé diferenciační dráze, než skutečnými rozdíly in vivo. - v závislosti na kultivačních podmínkách velmi rychle mění morfologii, což pravděpodobně- v závislosti na kultivačních podmínkách velmi rychle mění morfologii, což pravděpodobně vedlo k podezření na jejich pluri-/multipotentní schopnosti (zejména vznik neurálních b.) Stromální buňky kostní dřeněStromální buňky kostní dřeně potkana Populace vedlejších buněk (SP - side population) = SP buňky - izolovány z různých tkání jako buňky schopné intenzivně vylučovat DNA vázající fluorochrom Hoechst 33342, díky tzv. proteinu rezistence k farmakům = Abcg2 (BCRP ­ breast cancer resistence protein; rodina ,,multidrug resistance transporter(BCRP ­ breast cancer resistence protein; rodina ,,multidrug resistance transporter proteins"-MDR; obecně ABC (ATP binding cassette) transportery) - později prokázán fenotyp Sca1+/lin+---), byly isolovány z mnoha typů tkání i z nádorových (kostní dřeň, mléčné žlázy, plíce, svaly, srdce, játra, mozek, kůž, ....(kostní dřeň, mléčné žlázy, plíce, svaly, srdce, játra, mozek, kůž, .... a to jak u myši, potkana i člověka) - Jsou detekovatelné i v některých nádorových buněčných liniích (C6 ­ gliom; IMR-32, JF ­ neuroblastom; a různých gastroitestinálních nádorových líniích)(C6 ­ gliom; IMR-32, JF ­ neuroblastom; a různých gastroitestinálních nádorových líniích) Přes výše uvedené společné znaky SP buněk, jsou tyto buňky tkáňově specifické (???)jsou tyto buňky tkáňově specifické (???) - SP svalů mají myogení (Sca1+/CD45-) a hematopoetický potenciál (Sca1+/CD45+) - Hematopoetické SP jsou Sca1+/CD34+- Hematopoetické SP jsou Sca1+/CD34+ - SP kůže jsou Sca1+/K14+/K19+ - SP z mozku, ale i pankreatu (!) jsou Sca1+/nestin+ - .....- ..... V současné době nejsou plně objasněny vztahy/hierarchie mezi MSCs ­ MAPCs ­ BMSSCs ­ SP a dalšími somatickými kmenovými buňkami Je možné, že mnohé pozorované rozdíly jsou dány postupy izolace daných buněk,Je možné, že mnohé pozorované rozdíly jsou dány postupy izolace daných buněk, jejich kultivací in vitro nebo případně i dalšími nedostatky v přípravě vzorků apod. - v embryogenezi somity ­> myotom ­> myocyt ­> svalové vlákno Svalové SC ­ kmenové buňky kosterní svaloviny = MuSC - v embryogenezi somity ­> myotom ­> myocyt ­> svalové vlákno - v dospělosti MuSC -> satelitní buňky -> myocyt ­> svalové vlákno (kostní dřeň) (povrch svalového vlákna) - MuSC nejsou přesně definované, náleží zřejmě k užšímu výběru MSC- MuSC nejsou přesně definované, náleží zřejmě k užšímu výběru MSC - in vivo je sval regenerován satelitními buňkami, majícími vlastnosti SC - satelitní buňky se u myši objevují 17.5 dpc., s nástupem tvorby sekundárních svalových fibril (13 dpc. objevení primárních sv. fibril)sekundárních svalových fibril (13 dpc. objevení primárních sv. fibril) Původ satelitních buněk Dále byly izolovány z adultního kosterního svalu buňky CD34+/Sca1+ jakokosterního svalu buňky CD34+/Sca1+ jako kmenové buňky odvozené ze svalu (MDSC ­ muscle derived stem cells) Pax-7 Shi2006 sarkolema bazální membrána Shi2006 Satelitní buňky kosterní svaloviny a jejich úloha v regeneraci svalu Morgan2003 jejich úloha v regeneraci svalu Mechanismus regenerace svalového vlákna MuSC/satelitními buňkami (MSC) MPC ­ myogení progenitor M-cadherin desmin jádra Dynamika regenerace kosterního svalu Morgan2003 Dynamika regenerace kosterního svalu Shi2006 marker Satelitní buňky spící, časné? (quiescentní) Satelitní buňky spící (quiescentní) Satelitní buňky aktivované (quiescentní) Pax-7 + + +++ cMet (HGFR) + + + m-cadherin - + +m-cadherin - + + CD34 (L-selectinR) - + + Myf-5 - + + MyoD* - - +MyoD* - - + * Overexprese MyoD u fibroblastů je diferencuje do myogeních buněk Mechanismus regenerace svalového vlákna satelitními buňkami. Aktivace satelitních buněk (IGF 1,2, HGF,..) Fůze satelitních buněk Morgan2003 Fůze satelitních buněk Regenerace svalového vlákna Hematopoetické kmenové buňky ­ HSCs (hematopoietic stem cells) Hematopoéza + ? ?!?! HSC - Hematopoéza je v současné době zřejmě nejlépe prostudovaná diferenciační dráha HEMATOPOÉZA - Hematopoéza je v současné době zřejmě nejlépe prostudovaná diferenciační dráha s nejdokonalejším fenotypovým rozlišením jednotlivých buněčných stádií buněk tzv. CD (cluster determinants) antigeny.tzv. CD (cluster determinants) antigeny. - Jednotlivé diferenciační dráhy jasou často majoritně závislé na jediném cytokinu (kolonie stimulujícím faktoru ­ CSF; např. G-CSF, faktor stimulující tvorbu zejména granulocytů) - V průběhu ontogeneze je hematopoéza realizována jedinečným způsobem (časo-prostorově, viz. níže), což dobře umožňuje i studium rozdílů mezi embryonálními a adultními somatickými kmenovými buňkami. Každopádně v průběhu embryonálníhoa adultními somatickými kmenovými buňkami. Každopádně v průběhu embryonálního vývoje vznikají jisté typy populací T-lymfocytů, které zůstávají po celý život jedince, ale v dospělosti již nevznikají. Druhou možností, vedle možnosti odlišnostiale v dospělosti již nevznikají. Druhou možností, vedle možnosti odlišnosti embryonálních a adultních HSCs je schopnost těchto buněk osidlovat odlišné ,,niche". - HSC vzniklé ve žloutkovém váčku také migrují do oblasti AGM a do jater, kde dávají vznik adultním HSC (Samokhvalov, 2007)adultním HSC (Samokhvalov, 2007) - rozlišujeme: LT-HSC (long-term HSC) ­ schopné opakovaně kompletní obnovy hematopoézy : ST-HSC (short-term HSC) ­ schopné jen krátkodobé obnovy hematopoézy: ST-HSC (short-term HSC) ­ schopné jen krátkodobé obnovy hematopoézy (aktuální X potencionální kmenové buňka) - Harrison et al. (1979): transplantoval myším opakovaně identický štěp HSC déle jak 8 let - > výrazné překročení délky života myši!!! Vznik krevních ostrůvků ve vznikajícím Lokalizace, změna ,,niche" u hematopoézy v průběhu ontogenezeMOUSE Vznik krevních ostrůvků ve vznikajícím žloutkovém vaku mezi mezodermem a buňkami viscerálního entodermu ~7.5 dpc~7.5 dpc HSC HSC CFU-GM BFU-E CFU-E JÁTRA CFU-E JÁTRA ~11 dpc pB pT Hematopoéza v endotelu aorty (AGM), ~10.5 dpc Kostní dřeň, ~15 dpc S vývojem kostní dřeně se HSCs usazují v jejím pT pB pT Hematopoéza v endotelu aorty (AGM), ~10.5 dpc se HSCs usazují v jejím stroma. THYMUS pT pT, pB ­ lymfocytární progenitorypT, pB ­ lymfocytární progenitory CFU-GM ­ myeloidní progenitory BFU-E, CFU-E ­ erythroidní progenitory Podíl jednotlivých tkání na celkovém objemu hematopoézy mezi 11 ­ 13 dpc u myši Místo vzniku krevních ostrůvků (blood island) v průběhu embryogeneze u myši Pozn. Slezina je osídlena HSCs a hematopoetickými progenitory pravděpodobně z jater, protožepravděpodobně z jater, protože v době objevení se hematopoézy ve slezině, v žloutkovém vaku a v aortě už hematopoéza neprobíháv aortě už hematopoéza neprobíhá a kostní dřeň dosud není vyvinuta. Schema vývoje AGM (aorta-gonads-mesonephros) - začátek fetální hematopoézy Chronologie hematopoézy u člověka a myši hematopoéza/lymfopoéza člověk myšhematopoéza/lymfopoéza (dny) člověk myš embryonální vývoj (dny) ~270 ~21 žloutkový vak 18 7.5 dorsální aorta 27 9.5 thymus 40 11 játra 42 11 slezina 48 13 kostní dřeň 77 15 cirkulace krevních buněk 24 8.5 antigen HSC Myeloid SC Lymphoid SC Fenotyp HSC antigen HSC Myeloid SC Lymphoid SC CD10 (CALLA) - - + CD33 (Sialoadhesin) - + CD34 (L-selectinR) - + + CD38 (ecto-ADP-ribosyl cyclase) - - + CD90 (Thy1) + - + CD110 (Trombopoietin receptor) + + CD111 (Nectin1) - + CD112 (Nectin2) - + -CD112 (Nectin2) - + CD117 (c-Kit, SCFR) + + + CD123 ( řetězec IL-3R) + + CD124 (IL-4R/IL-13R) - - +CD124 (IL-4R/IL-13R) - - + CD127 ( řetězec IL-7R) - - + CDw131 ( řetězec IL-3R/IL-5/GM-CSF) - + CD133CD133 (Ac133) - + CD135 (Flt3/Flk2) + - CD173 (krevní skupina H typ 2) - + CD174 (Lewis Y) - + CD176 (Thomson-Friedrenreich antigen) - + CD227 (MUC-1) - + -CD227 (MUC-1) - + CD228 (Melanotrensferrin) - + + CD243 (MDR-1) + - - Extrinsic a intrinsic faktory regulující sebeobnovu adultních HSC (Okala, 2006) Schema hematopoézy a fenotypSchema hematopoézy a fenotyp aktuálních a potencionálních HSC Kmenové buňky v pupečníkové krvi (v allantois) Pupečníková krev obsahuje hematopoetické progenitory existující, jako pozůstatek extraembryonálních krevních ostrůvků a endotelie. Díky tomu, jsou tyto buňky geneticky shodné a fenotypově velice blízké vlastním krevním buňkám embrya a je možné je takshodné a fenotypově velice blízké vlastním krevním buňkám embrya a je možné je tak snadno použít jako transplantační štěp pro z tohoto embrya vzniklého jedince. Jejich množství lze navíc navýšit indukcí jejich proliferace koktejlem pro-hematopoetických cytokinů.cytokinů. V současnosti bylo publikováno, že pupečníková krev může být také zdrojem mesenchymálních buněk, snad podobné MSCs i s jejich potencí. Tyto výsledky je však třeba ještě důkladně ověřit.třeba ještě důkladně ověřit. 7.5 dpc 12.5 dpc Endotel - jednovrstevný dlaždicovitý epitel tvořený endotelovými buňkami adherovanými- jednovrstevný dlaždicovitý epitel tvořený endotelovými buňkami adherovanými k bazální membráně - tvoří výstelku cév případně cévy samotné (mikrokapiláry) - v případě cév jsou z druhé strany bazální membrány buňky hladké svaloviny- v případě cév jsou z druhé strany bazální membrány buňky hladké svaloviny a podle typu orgánu také množství pericytů (viz. mesenchym), pericyty jsou i v mikrokapilárách - endotel je prostupný pro pericyty, monocyty/makrofágy, leukocyty a lymfocyty- endotel je prostupný pro pericyty, monocyty/makrofágy, leukocyty a lymfocyty - endotel je také významným zdrojem mnoha růstových faktorů, díky tomu hraje významnou úlohu v homeostázi dané tkáně - obnova endotelu probíhá z endotelových progenitorů (kmenových buněk?), které jsou vmezeřeny mezi endoteliemi, případně plavou v krevním řečišti. - některé práce ukazují na společného předchůdse endotelií a HSCs (CD31+/- ­ PECAM1 (Platelet endothelia cell adhesion molecule 1), CD34+, CD45+) případně také na schopnost vzájemné transdiferenciace těchto dvou buněčnýchpřípadně také na schopnost vzájemné transdiferenciace těchto dvou buněčných populací. Adultní progenitory pro hematopoézu a endotelie byly isolovány z krve a kostní dřeně s fenotypem CD34+, Flk-1+, AC133. Podobně bylo prokázán společný progenitor v průběhu embryogeneze pro endotelieprokázán společný progenitor v průběhu embryogeneze pro endotelie a buňky hladké svaloviny. Jestli takový progenitor existuje i v dospělosti není dosud známo. Armulik 2006 Srdce, srdeční sval a jeho regenerace Kardiomyocyty + Endotelie + specializované svalové buňky Hisova svazku a Purkyňových vláken + SP apod.?? + vazivo (fibroblasty)?a Purkyňových vláken + SP apod.?? + vazivo (fibroblasty)? Srdeční sval může mohutnět zejména hypertrofií svých buněk, ne jejich namnožením, a tak možnosti autonomní regenerace po poškození jako je infarkt myokardu, ischemiea tak možnosti autonomní regenerace po poškození jako je infarkt myokardu, ischemie apod.., jsou značně omezené. Proto jsme se domnívali, že myokard neobsahuje zásobu progenitorů k reparaci. Navíc se výraznější dělení kardiomyocytů zastaví časně po narození, stanou se senescentními a jejich počet se během života již za normálníchpo narození, stanou se senescentními a jejich počet se během života již za normálních okolností zásadně nezvětšuje. Některé recentní práce však ukazují, že i u srdce můžeme předpokládat jistéNěkteré recentní práce však ukazují, že i u srdce můžeme předpokládat jisté regenerační schopnosti, a to buď díky zbytkovým progenitorům nebo schopností (některých?) kardyomyocytů proliferovat v odpověď na poškození. Byla také prokázána schopnost regenerace srdce cirkulujícími progenitory,Byla také prokázána schopnost regenerace srdce cirkulujícími progenitory, jak ukazují sex-mix transplantace srdce. Analýza distribuce X chromosomu ukázala, že se pravděpodobně nejedná o fůzi buněk, ale o diferenciaci progenitorů (SCs ?), přesto jiné práce prokázali jen fúzi mezi buňkami. - využití transplantátů např v podobě kardiomyocytů získaných z ES buněk je zdá se komplikovanou jinou synchronizací tepu.komplikovanou jinou synchronizací tepu. Tyto regenerující buňky jsou pravděpodobně SP a c-kit+ buňky kostní drěně (MSCs?)1), i po injikaci, se přednostně usazují např. v místě ohraničujícím infarkt2).(MSCs?)1), i po injikaci, se přednostně usazují např. v místě ohraničujícím infarkt2). Mechanismus regenerace srdečního svalu nemusí však být spojen přímo s diferenciací těchto zde se akumulujících buněk, ale může být vyvolaný také růstovými faktory, které tyto buňky produkují (viz. MSCs) a tak stimulují buď samotnéfaktory, které tyto buňky produkují (viz. MSCs) a tak stimulují buď samotné kardiomyocyty, nebo a to spíše endotelové buňky vystýlající místní cévy. Endotel snad sám o sobě má regenerační schopnosti pro některé tkáně3). Není však dosud jasné zda tento regenerační (transdiferenciační ?) potenciál mají samotné endotelie nebo další typy buněk nacházející se v přímém kontaktu s endotelem (SP buňky, MSCs?, fibroblasty). 1) MSCs, SP buňky, BMSSCs, MAPCs, se ¨v malém množství vyskytují i v krevním řečisti. V návaznosti na požkození organismu, podle některých teorií, se počty těchto MSCs?, fibroblasty). řečisti. V návaznosti na požkození organismu, podle některých teorií, se počty těchto buněk v krvi zvětšují. 2) ,,Signál poškozené tkáně". Cirkulující (i např MSCs / BMSSCs) progenitorové,,Signál poškozené tkáně". Cirkulující (i např MSCs / BMSSCs) progenitorové a kmenové buňky mají tendence (zřejmě podobně jako buňky imunitního systému) akumulovat se v poškozené tkáni. Podstata tohoto signálu není přesně známa. Zřejmě je však podobného charakteru jako známe z imunitních reakcí a z procesůZřejmě je však podobného charakteru jako známe z imunitních reakcí a z procesů regenerace (chemoatraktanty ­ chemotaxe, pathotaxe) 3) Je podezření, že endotel může dávat vznik hematopoetickým progenitorům (viz. např. hematopoéza v stěně dorsální aorty (AGM) embrya a extraembryonální prvotní krevnínapř. hematopoéza v stěně dorsální aorty (AGM) embrya a extraembryonální prvotní krevní ostrůvky průběhu embryonálního vývoje atd.. Hypotetické možnosti regenerace srdečního svalu Progenitory ,,kmenové buňky" z krevního oběhuz krevního oběhu Spící progenitorySpící progenitory kardiomyocytů (SCs?) Proliferace kardiomyocytů Detekce buněk v srdeční svalovině exprimujících c-kit (zelená) MDR1 (růžovo-fialová) Sca1(žlutá)c-kit (zelená) MDR1 (růžovo-fialová) Sca1(žlutá) von Willebrandův faktor (bílá) Kostra - skelet chrupavka (chondrocyty) + kost (osteoblasty a osteoklasty) - vývoj končí v pubertě klidová zóna MESODERMchondrocyty klidová zóna MSC ? proliferační zóna HSC chondrogeneze ? ? proliferační zóna chondrogeneze osteoblast Runx2* -> Osx Fos, Fos, Fra-1 ? ? růstová zóna chondrogeneze osteoklastENDOTEL Fos, Fos, Fra-1 ? růstová zóna osteoblast (mineralizující) Osteocalcin osteoklastENDOTEL apoptóza -- ontogenezeOsteocalcin *Runx2 -/-, jen chrupavka apoptóza vaskularizace osifikace -- ontogeneze -- regenerace fenotyp chondrocytů v průběhu jejich diferenciace chondrocyty klidová zóna chondrocyty kolagen II Sox9* PTHrP Sox9* Runx2 PTHrP tmavší = výší exprese chondrogeneze proliferační zóna Sox5,Sox6 Runx2 Ihh Fgfr3 chondrogeneze L-Sox5,Sox6 Ihh růstová zóna Ihh ­ Indian hedgehog PTHrP ­ od parathyroidního hormonu kolagen X odvozený peptid (PTH-related peptide) Fgfr3 ­ receptor 3 pro FGFs * Sox9 aktivuje expresi kolagenů typu II, IX, XI Sox9 -/-, nevznikají chondrocyty Ledviny - velice malá schopnost regenerace- velice malá schopnost regenerace - složitý vývoj, různá regulace a odlišné typy buněk mezi pronefros, mesonefros a metanefros - multipotentní buňky, kultivovatelné in vitro a integrující se v různých- multipotentní buňky, kultivovatelné in vitro a integrující se v různých oblastech ledviny objeveny ve stěně renálních papil (Oliver 2004) - klíčové geny pro vznik ledvin: lim1 (homeoboxový gen); transkripční faktory Pax2, Pax8Pax2, Pax8 - geny klíčové pro regulerní vývoj ledvin: Wnt4, BMP7; transkripční faktor FoxD1, pod-1; PDFG/PDGFR SSC ,,entodermálního" původu Játra a pankreas Během embryogeneze vznikají játra a pankreat ze společného progenitoru/kmenové buňky.Během embryogeneze vznikají játra a pankreat ze společného progenitoru/kmenové buňky. Přítomnost takové buňky v dospělém organismu, však nebyly dosud prokázána. Játra a) vlastní jaterní buňky hepatocyty (albunim), oválné buňky (vlastní jaterní kmenové buňky, c-kit, SCF, Thy1 albumin / CK19), epiteliální buňky žlučovodu (CK19), hvězdicovité buňkyalbumin / CK19), epiteliální buňky žlučovodu (CK19), hvězdicovité buňky b) další typy buněk v játrech endotelie, krevni elementy, Kupferovy buňky, SP buňky,..endotelie, krevni elementy, Kupferovy buňky, SP buňky,.. Jaterní tkáň běžně regeneruje proliferací vlastních hepatocytů (hepatotektomie), případně proliferací a diferenciací oválných buněk (otravy, požkození chemikáliemi).případně proliferací a diferenciací oválných buněk (otravy, požkození chemikáliemi). Jednotlivé typy buněk jsou jsou preferovány podle typu požkození. Hlavní proliferaci indukující faktor je HGF (hepatocyte growth factor), na celkové regulaci regenerace se pak podílejí i IL-6 (interleukin 6), TNF (tumor necrosis factor ),regenerace se pak podílejí i IL-6 (interleukin 6), TNF (tumor necrosis factor ), TGF (transforming growth factor ), EGF (epidermal growth factor ) - regenerace jater HSCs: c-kit+++, Thy+--, Lin-, Sca1+ (fenotyp KTLS)- regenerace jater HSCs: c-kit+++, Thy+--, Lin-, Sca1+ (fenotyp KTLS) z kostní dřeně tvoří po transplantaci do jaterní tkáně, zdá se funkční hepatocyty - regenerace jater MAPCs a BMSSCs: MAPCs se usazují v játrech (chiméry- regenerace jater MAPCs a BMSSCs: MAPCs se usazují v játrech (chiméry i transpalntace) a i in vitro dávají vznik hepatocytů (?!). BMSSCs, se usazují v játrech, ale zdá se, že zejména fůzují s tamními hepatocyty (časté karyotypy při sex-mix transplantacích jsou XXXY a XXXXYY). Plná funkčnost těchto MAPCs a BMSSCs derivátů však zatím nebyla prokázána.a BMSSCs derivátů však zatím nebyla prokázána. Model zapojení se HSCs / hematopoetických progenitorů v regeneraci jaterv regeneraci jater oc ­ regenerace z oválných buněkoc ­ regenerace z oválných buněk nt ­ normální obnova jaterní tkáně pt ­ obnova jaterní tkáně po odstranění její části Pankreas a) exokrinní buňky (trávicí enzymy) a epiteliální buňky tvořící kanálkya) exokrinní buňky (trávicí enzymy) a epiteliální buňky tvořící kanálky pro odvod těchto enzymů do dvanáctníku b) endokrinní buňky (glukagon), (insulin), (somatostatin) a pp-buňky (pankreatický polypeptid)(pankreatický polypeptid) - prekurzor pankreatu (embryonální) exprimuje transkripční faktor ,,pdx1" - poslední studie ukazují, že buňky se neobnovují z kmenových buněk,- poslední studie ukazují, že buňky se neobnovují z kmenových buněk, ale svou vlastní pomalou proliferací. Exprimují insulin, Pax6, HNF3,.. - endokrinní buňky mají velice podobný vývojový program jako buňky neurálnívývojový program jako buňky neurální (NeuroD, is11, Nkx2.2, Nkx6.2,...) rozdíl je zejména v insulinu a pdx1 - epiteliální buňky kanálků se sebeobnovují buňkypodobně také exokrinní buňky acinů - SCs pankreatu nebyly dosud objeveny - diferenciace BMSSCs (?) do buněk byla jednou prokázána, ale nezopakována buňky jednou prokázána, ale nezopakována - buňky pankreatu mohou tvořit hepatocyty u člověka spontálně (in vivo), u potkana to lze navodit experimentálně, opačněto lze navodit experimentálně, opačně to nefunguje, avšak exogenní exprese pdx1 v hepatocytech z nich dělá buňky exprimující insulin a znaky exokrinníchexprimující insulin a znaky exokrinních buněk, podobné i u buněk embryonálního epitelu střeva Kmenové buňky střevního epitelu STŘEVNÍ EPITEL (u hlodavců se kompletně obmění ~ po 4 dnech)STŘEVNÍ EPITEL (u hlodavců se kompletně obmění ~ po 4 dnech) pohárkové buňky ­ hlen Panethovy buňky ­ bakteriocidní faktory (lysozym, defensiny + TNF) epiteliální buňky (apikální mikrovili) ­ resorpceepiteliální buňky (apikální mikrovili) ­ resorpce Neuro / enteroendokrinní buňky ­ peptid. hormony M-buňky ­ přenos antigenu k lymfocytům Peyerových plátů kmenové buňky střevního epitelukmenové buňky střevního epitelu mesenchymální buňky ,,lamina propria" fibroblasty, fibrocyty, endotelie, buňky hladkéfibroblasty, fibrocyty, endotelie, buňky hladké svaloviny, a střevní subepiteliální myofibroblasty - ISEMF (intestinal subepithelial myofibroblast) které produkují růstové faktory regulujícíkteré produkují růstové faktory regulující proliferaci a diferenciaci epiteliálních buněk (HGF, KGF, TGF2) endokrinníendokrinní pohárkové epiteliální Panethovy tenké střevo tlusté střevo Předpokládá se, že všechny buňky každé střevní krypty jsou potomky jediné kmenové buňkyjediné kmenové buňky (klonální studie s chimérami) Jednotlivé krypty se pak množí dělením (dané velikostí krypty)(dané velikostí krypty) Nejklíčovějších faktory regulující deferenciaci střevního epiteluNejklíčovějších faktory regulující deferenciaci střevního epitelu jsou Wnt, BMP a Notch. V případě tlustého střeva také gradient NaBt, produkovaného bakteriemi v jeho lumen. APC ­ adenomatous polyposis coliAPC ­ adenomatous polyposis coli Pozn. MSCs/BMSSCs se mohou integrovat do střevního epitelu, ale neplníPozn. MSCs/BMSSCs se mohou integrovat do střevního epitelu, ale neplní zde funkci epiteliálních buněk. Integerují se i do lamina propria, tvoří ISEMFs a produkcí růstových faktorů podporují proliferaci střevního epitelu (viz. MSCs) Plíce PLICNÍ EPITEL (u hlodavců se kompletně obmění ~ po 100 dnech) Proximální část plic (trachea a velké průdušnice/bronchy) - epiteliální buňky s ciliemi (Foxj1+) - Clara a buňky podobné Clara buňkám (Scgb1a1 ­ sekretoglobin+)(Scgb1a1 ­ sekretoglobin+) - bazální buňky (p63+) - neuroendokrinní buňky Distální část plic (průdušky, průdušinky a alveoli) - epiteliální buňky s ciliemi (Foxj1+) - Clara buňky (Scgb1a1+)- Clara buňky (Scgb1a1+) - varianta Clara buněk - Clara V - neuroendokrinní buňky, tvořící neuroendokrinní tělíska (NEBs, exprimujítělíska (NEBs, exprimují od calcitoninu odvozený peptid ­ Cgrp+) - buňky typu I a II v alveolech. Typ II produkuje proteinové surfaktanty, typ I těsně přiléhá ke kapilárámproteinové surfaktanty, typ I těsně přiléhá ke kapilárám - bronchoalveolární kmenové buňky (BASCs) Opravné mechanismy v proximální části plic basální buňky (1) SP buňky? (2) ? epitelie* (3) Clara** (4)Clara** (4) buňky s ciliemi (3) * epiteliální buňky submukózních žlaz, mohou regenerovat epitel průdušnic ciliemi (3) * epiteliální buňky submukózních žlaz, mohou regenerovat epitel průdušnic ** nahrazují buňky s ciliemi po požkození oxidanty Opravné mechanismy v distální části plic BASC (1,2) ClaraV multipotentí BASCs mají fenotyp Sca1+, CD34+, CD45-, Sftpc/Scgb1a1+ (1,2) ClaraV (1) ??? naphtalen TA progenitor TA progenitor ??? progenitorprogenitor neuro- endokrinní buňky (6) Clara (4) typ I NO2 buňky s ciliemi (3) typ II * bleomycin ciliemi (3) (5) *umí to všechny Clara buňky ?! naphtalen SSC ,,ektodermálního" původu Neurální kmenové buňky ­ NSCs (Neural stem cells)(Neural stem cells) Gl ­ glomerularní vrstva Gr ­ granulární vrstva EPl ­ vnější plexiformní vrstva Mi ­ vrstva mitral buněkMi ­ vrstva mitral buněk IPL ­ vnitřní plexiformní vrstva cc - corpus callosum LV - lateral ventricle CPu - caudate putamen (striatum) a) b) CPu - caudate putamen (striatum) DG - dentate gyrus SN - substantia nigra lokalizace NSCs a) subventrikulátní zóna (SVZ), postranní komory b) subgranulární vrstva DGb) subgranulární vrstva DG Oblast s NSCs obsahuje čtyři typy buněk 1) pomalu proliferující, astrocytům podobné (GFAP+/nestin+/SSEA1+/CD133+)1) pomalu proliferující, astrocytům podobné (GFAP+/nestin+/SSEA1+/CD133+) buňky - typ B = NSCs 2) spící, případě potřeby intenzivně proliferující buňky vzniklé z buněk B - typ C (TA progenitory, přechodně/transientně se dělící progenitory) radial (TA progenitory, přechodně/transientně se dělící progenitory) 3) z buněk typu C vznikají buňky A = neuroblasty 4) ependymální buňky - typ E radial glia*Shh; Delta/Notch -> Hes Sox1, 2, 3; Emx2; Zic1; Pax6 B (NSC) embryo E ? (NSC) EGF (in vitro) C E (ependym) glia EGF (in vitro) C (TA) glia prekursor astrocytoligo- dendrocyt A (neuroblast) migrace neurony *radiální glie ­ embryo a časně postnatálně - NSCs jsou široce multipotentní a experimenty s chimérami ukázaly, že NSCs dávají Další charakterizace NSCs - NSCs jsou široce multipotentní a experimenty s chimérami ukázaly, že NSCs dávají vznik buňkám všech tří zárodečných listů (netvoří pohlavní buňky, nebylo prokázáno) - u chimér se také NSCs nepodílí na hematopoéze i přesto, že v případě likvidace hematopoézy zářením, injikované NSCs ji obnoví (obojí děláno s myšmi ROSA26)hematopoézy zářením, injikované NSCs ji obnoví (obojí děláno s myšmi ROSA26) - na druhou stranu není jasné, zda NSCs tvoří všechny typy nervů a glií - neurální multipotentní progenitory byly izolovány i z retiny, optického nervu, hypothalamu, čichových laloků, čichového epitelu, a míchyhypothalamu, čichových laloků, čichového epitelu, a míchy - tyto směsné populace nejsou schopné dlouhodobé proliferace in vitro tak jako NSCs a také si zachovávají některé epigenetické znaky podle místa původu - po poškození mozku je možno neurogenezi detekovat i v striatu, neokortexu nebo v místech kortiko-spinálních motoneuronů - NSCs s věkem ubývá, podobně jako ostatní adultní SSCs, každopádně je lze izolovat z mozkové tkáně i několik hodin (4-6h) po diagnóze klinické smrti - in vitro se NSCs kultivují v podobě tzv. ,,neurosfér" ve speciálních médiích určených- in vitro se NSCs kultivují v podobě tzv. ,,neurosfér" ve speciálních médiích určených pro expanzi neurálních progenitorů, bez séra, ale s nadbytkem FGF2 a EGF - ,,neurosféry" jsou plovoucí útvary s navýšeným množstvím neurálních progenitorů a NSCs, lze v nich detekovat již i množství zralejších typů nervů i gliía NSCs, lze v nich detekovat již i množství zralejších typů nervů i glií - i neurální progenitory (TA) lze dlouhodobě kultivovat Chimerická blastocystaChimerická blastocysta vytvořená po smíchání blastomer normální a ROSA26 myši a myší embrya (11 dpc) normální a s ROSA26 chimerické myši.normální a s ROSA26 chimerické myši. Clarke 2000 NSC jsou také schopny rekonstruovat hematopoézu (Bjornson 1999) Epiteliální kožní kmenové buňky ­ ESSCs (Epithelial skin stem cells)(Epithelial skin stem cells) Kůže ­ dermis (mesoderm -> mesenchym) + epidermis (ektoderm) ESSCs (Integrin 6+/CD71-/K15+/K19+/CD34+)1 jsou lokalizovány ve výduti po straně vlasové pochvy.lokalizovány ve výduti po straně vlasové pochvy. Odtud v případě potřeby migrují jak do bazální vrstvy krycí epidermis, tak k základu vlasu k dermální papile2. V základně vlasu, u dermálník dermální papile . V základně vlasu, u dermální papily, ESSCs vytváří ,,sekundární" populaci kmenových buněk, odpovědných za růst vlasu. V basální vrstvě epidermis dávají vznik aktivněV basální vrstvě epidermis dávají vznik aktivně se dělícím keratinocytům, exprimujícím keratiny K5 a K14. Po jejich přechodu do ,,stratum spinosum" se tyto keratinocyty přestanou dělitspinosum" se tyto keratinocyty přestanou dělit a nastupují proces terminální diferenciace kdy keratiny K5/K14 jsou nahrazeny keratiny K1 a K10. Poté dochází k syntéze bariérových proteinů jako je involucrin, loricrin,..., zplošťováníproteinů jako je involucrin, loricrin,..., zplošťování buněk a jejich odumírání. 1 CD71 ­ receptor pro transferin 2 dermální papila je shluk mesenchymálních buněk reguljící růst chlupu *IRS ­ vnitřní vlasová pochva ORS ­ vnější vlasová pochva (inner / outer root sheath) Specializace a signalizace v epidemis pre-ORS ORS* IRS*pre-IRS vlasové pochvy (inner / outer root sheath) ESSC Tcf3+ matrix pre-cortex cortex vlas Noggin (dermal papila) Lef1+ GATA3+ Tcf3, Lef1 matrix (dřeň) pre-cortex cortex (kůra)Wnt BMP Lef1+Tcf3, Lef1 pre- sebocyt commited BMP sebocytepidermis mazové žlázyepidermis cytokiny transkripční faktory Morfologie epidermis a vlasové cibulky Poznámka.Poznámka. Epiteliální kmenové buňky podobné ESSCs byly také nalezeny v oční rohovce. Tyto buňky jsou zde pravděpodobněbuňky jsou zde pravděpodobně pouze bipotentní, avšak po jejich přenosu do epidermis, se chovají jako ESSCs a jsou multipotentní!jako ESSCs a jsou multipotentní! Nádorové kmenové buňky - CSCs (Cancer stem cells)(Cancer stem cells) Původ CSCs a) somatické kmenové buňkya) somatické kmenové buňky b) TA buňky (progenitory)* Podstatou je akumulace chyb v regulaci bPodstatou je akumulace chyb v regulaci diferenciace, proliferace a apoptósy. Tyto chyby mohou být jak na základě poškození/změn DNA (genů ­ mutace, a b poškození/změn DNA (genů ­ mutace, translokace,..), tak na úrovni epigenetických mechanismů, případně kombinací obou. a kombinací obou. => chybná odpověď na vnější signály (růstové faktory, proteiny ECM, buňky)(růstové faktory, proteiny ECM, buňky) Jordan 2006 * Lze i experimentálně navodit zvýšením exprese oncogenů, např ras + myc. Kmenové buňky nádorů jsou zodpovědné za návrat (relaps) onemocnění a metastáze CSCs podobně jako jiné SSC -> rezistence na toxické faktory (MDR proteiny)CSCs podobně jako jiné SSC -> rezistence na toxické faktory (MDR proteiny) -> pomalá proliferace (=>self-renewal) Jordan 2006 - mají všechny nádory benigní/maligní/metastázující CSC? - ne všechny buňky izolované z nádorů jsou schopny dávat nádorům vzniknout - in vitro jsou nádorové linie s SP buňkami (jejich SC ???) i bez SP buněk!- in vitro jsou nádorové linie s SP buňkami (jejich SC ???) i bez SP buněk! - SSCs jsou pro danou tkáň prakticky stejné, u CSCs to ale neplatí (rozdíly ve fenotypu i genotypu) = mnohé nádory i CSCs mají jediněčné vlastnosti! Model regulace tumorogenezeModel regulace tumorogeneze přesmykem aktivity MAPK Erk a p38 Ranganathan 2006 A ­ znázornění progrese nádoru u pacienta B ­ proliferace x dormance (quiescence) nádorových buněk v závislosti na aktivitě MAPK Erk a p38 C ­ mechanismus aktivace Erk a p38C ­ mechanismus aktivace Erk a p38 CC Dobře prokázané CSCs jsou u nádorů původu neurálního hematopoetického prsníhoneurálního hematopoetického prsního Jordan 2006 Hematopoetické CSCsHematopoetické CSCs chronická myeloidní leukemie (CML) akutní myeloidní leukemie (AML) akutní lymfoblastická leukemie (ALL)akutní lymfoblastická leukemie (ALL) CSCs byly jasně prokázány u AML a CML, a jsou s vysokou pravděpodobností i u ALL. Díky tomu, je u těchto onemocnění nedostatečné působení běžných antiproliferativních farmak.antiproliferativních farmak. AML - IL3-R+ (není u normálních HSCs), CD33+ (IgSF, sialoadhesin) - CD33 se zdá být vhodným pro rozpoznání AML CSCs (imunoterapie),- CD33 se zdá být vhodným pro rozpoznání AML CSCs (imunoterapie), navíc byl prokázán u některých dalších leukemických CSCs. - vysoká aktivita NF-B a PI3K u AML SCs, ale ne u HSCs, farmakologická inhibice NF-B a PI3K nebo mTOR (target of rapamycin; substrát PI3K)inhibice NF-B a PI3K nebo mTOR (target of rapamycin; substrát PI3K) snižuje proliferaci AML SCs, ale ne HSCs (=>CSCs specifická terapie) CML - charakteristický fůzní gen BCR-ABL (=> nadbytek ABL kinázy), inhibitoryCML - charakteristický fůzní gen BCR-ABL (=> nadbytek ABL kinázy), inhibitory ABL (imatinib mesylate, dasatinib) potlačují leukemii, ale ne její SCs, => vysazení vede k obnově onemocnění Neurální CSC - NCSCNeurální CSC - NCSC - neurální CSCs se připravují a vytvářejí (v kultuře) podobně jako NSCs sférické plovoucí- neurální CSCs se připravují a vytvářejí (v kultuře) podobně jako NSCs sférické plovoucí útvary (= neurosféry) - neurosféry mohou být rozsuspendovány na jednotlivé buňky, z nichž některé jsou- neurosféry mohou být rozsuspendovány na jednotlivé buňky, z nichž některé jsou multipotentní a jsou schopné vytvořit novou neurosféru, případně dávat vznik všem známým skupinám neurálních buněk (neurony + glie, stejné pro NSC i NCSC) - NSCs i NCSCs exprimují povrchový antigen CD133 (AC133), u některých gliomů bylo prokázáno, že pouze CD133+ buňky izolované z těchto nádorů jsou schopné tyto nádory po transplantaci vyvolávat, kdežto ostatní buňky ze stejného nádoru ne,nádory po transplantaci vyvolávat, kdežto ostatní buňky ze stejného nádoru ne, a to ani v případě aplikace o 104 vyšší koncentrace buněk - u NCSCs je také dobře prokázán vznik jak z NSCs, tak z neurálních prekurzorů- u NCSCs je také dobře prokázán vznik jak z NSCs, tak z neurálních prekurzorů (TA buněk, pro které jsou známy dlouhodobé kultivační podmínky pro růst in vitro) SC a CSC mléčných žlaz ­ MaSC a MaCSC (Mammary CSC) - MaSCs ­> SP populace Sca1+ a liniově negativních (B220­, Gr-1­, Mac-1­, CD4­,- MaSCs ­> SP populace Sca1 a liniově negativních (B220 , Gr-1 , Mac-1 , CD4 , CD5­ a CD8­) buněk tvořících ,,mammosféry" (podobně jako neurosféry obsahují jak SCs, tak množství progenitorů a diferencovanějších typů buněk) - kmenové buňky mléčných žlaz jsou schopné dát vznik prsní tkání po transplantaci do vhodného prostředí - z metastázujících prsních nádorů byly izolovány buňky CD44+/CD24-, schopné tyto nádory vyvolávat po následné transplantaci, oproti 100 násobnému množství ostatních buněk izolovaných z takového nádorubuněk izolovaných z takového nádoru - pravděpodobně ne všechny CD44+/CD24- mají potenciál CSC - CD44+/CD24- buňky nejsou také pravděpodobně odvozeny od MaSCs ale od TA LT-LCR (long term label retaining cell) ST-LRC (short term LRC) ER ­ receptor pro estrogen PR ­ receptor pro progeteronPR ­ receptor pro progeteron CD24 ­ povrchový protein s GPI kotvou CD44 (H-CAM) Woodward, 2005 METAPLASIE (- TRANSDIFERENCIACE?!) metaplasie ­ přeměna kmenové nebo progenitorové buňky jednohometaplasie ­ přeměna kmenové nebo progenitorové buňky jednoho typu tkáně v progenitor tkáně jiné transdiferenciace ­ přeměna buňky jednoho typu na buňku typu jiného bez průchodu buněčným cyklembez průchodu buněčným cyklem transdeterminace ­ metaplasie v průběhu embryogeneze Rawlins & Hogan (2006) Development 133, 2455-2465 Potenciální možnosti: 1) Přímá přeměna fenotypu buňky jednoho typu v buňku typu jiného - s proliferací (metaplasie)- s proliferací (metaplasie) - bez proliferace (pravá transdiferenciace) 2) Prvně směrem zpět v diferenciační řadě a následně diferenciace2) Prvně směrem zpět v diferenciační řadě a následně diferenciace do jiné diferenciační řady (rediferenciace a následně diferenciace). Za pozorované jevy zřejmě ale odpovídají zbytkové populace progenitorů. - s proliferací- s proliferací - bez proliferace (silně nepravděpodobná existence) Přístupy:Přístupy: a) Vnějšími faktory b) Exogenní expresí vhodných genů c) Přeprogramováním jádra cytoplasmou jiné buňkyc) Přeprogramováním jádra cytoplasmou jiné buňky (sem patří i terapeutické klonování) d) Kombinací výše zmíněných postupů ? ??diferencované buňky ? ? diferenciace ? ? ? diferenciace ?SC / TA transdeterminace - změny v metylaci DNA / metylačním paternu (CpG a CpA oblasti) tyto modifikace jsou relativně obtížně změnitelné - změny v metylaci / acetylaci / fosforylaci histonů- změny v metylaci / acetylaci / fosforylaci histonů - telomery / telomerázy - změny v PcG proteinech => transkripce jiných genů = jiný fenotyp A. vnějšími faktory - málá a často sporná účinnost - závislé na buněčném typu, často jen u SCs a TA buněk - pokud je to možné, tak se většinou jedná o malou změnu / krok (!není úplně jasné, jestli je potřeba rediferenciace!)(!není úplně jasné, jestli je potřeba rediferenciace!) - uplatnitelnost in vitro spíše s některou z dalších metod a zejména pro zachování získaného fenotypu re- / transdiferencovaných buněk Příklady: - exokrinní buňky pankreatu -> hepatocyty- exokrinní buňky pankreatu -> hepatocyty - epitel hltanu -> střevní epitel (po poškození žaludečními kyselinami, tzv. Barrettova metaplasie) - progenitory glií ???- progenitory glií ??? - pigmentové buňky oka (iris) -> buňky rohovky (u čolka) - některé kultivační experimenty ukazují, že různé progentory / SCs mohou nabývat fenotypu jiní diferenciační řady,mohou nabývat fenotypu jiní diferenciační řady, např SCs / TA epidermis x nervová tkáń - B-lymfocyty mohou tvořit makrofágy B. exogenní exprese vhodných genů - výrazně účinější než působení vnějších faktorů - ,,vhodné" geny jsou zejména cytoplasmatické pro-onkogeny / onkogeny- ,,vhodné" geny jsou zejména cytoplasmatické pro-onkogeny / onkogeny a transkripční faktory - epigenetická paměť buněk (zejména metylace DNA), ale zřejmě nedovoluje úplnou změnunedovoluje úplnou změnu Příklady: - nadbytečná exprese RasRas a c-MycMyc indukuje částečnou rediferenciaci a transformaci - exprese Pdx1Pdx1 (marker -buněk pankreatu) navozuje částečný fenotyp -buněk u hepatocytu a střevních epiteliálních buněku hepatocytu a střevních epiteliálních buněk - exogení exprese cc--Myc, Klf4, Oct4 a Sox2Myc, Klf4, Oct4 a Sox2 navozuje fenotyp ESCs => IPSCs u embryonálních fibroblastů (myš) - transdeterminace Pax a Hox geny (např. Pax-6 a oči) C. Přeprogramováním jádra cytoplasmou jiné buňkycytoplasmou jiné buňky - závislost na momentálním stavu buňkybuňky - velice účinné, ale přenos jádra málo úspěšný u savců - fůze buněk je ale relativně běžná- fůze buněk je ale relativně běžná buněčná fůze ­ spojení cytoplasmy a jader dvou buněk za vzniku buňkydvou buněk za vzniku buňky jediné heterokaryon ­ produkt fůze buněk jasně odlišitelnými dvěma nebo i více jádryi více jádry hybridní buňka ­ vznikne když heterokaryon projde mitózou za vzniku buňky s jedním jádrem ale s více jak 2n DNA (nemusí obsahovat2n DNA (nemusí obsahovat kompletní jadernou DNA původních buněk) Úplné reprogramování terminálně diferencované buňky cytoplasmou Heterokaryon Purkiňova neuronu v mozečku a GFP+-BMSSC diferencované buňky cytoplasmou oocytu u žab (ale i savci). BMSSCs exprimující -galaktosidásu pod kontrolou svalově specifickéhopod kontrolou svalově specifického promotoru Myš klonovaná z jádra čichového nervu Regenerace samičích Fah -/letálních jater (FAH ­ fumarylacetoacetate hydroláza) transplantací samčích HSCssamčích HSCs Detekce Y chromozomu v játrech po transplantaci (dole) a FAH aktivity vpravo nahoře. Reprogramování jádra, metylace DNA a chyby v embryogenezi Demetylace otcovského, mateřského a reprogramovaného (jaderný přenos) genomugenomu Analýza exprese Oct4 mRNA u klonovaných a kontrolních blastocyst (in situ hybridizace).a kontrolních blastocyst (in situ hybridizace). Účinek reprogramování jádra diferencované buňky na expresi Oct4-GFP a schopnost růstu ICM.růstu ICM. Vývoj klonů a IVF/ICSI embryí exprimujících GFP in vitro.