Tkáňové kulturyTkáňové kultury
E-mail: jipa@sci.muni.cz
Tel: 532 146 223 / 116
Tkáňové kultury (= TK, Tissue culture - TC)
­ růst živočišných buněk a tkání in vitro­ růst živočišných buněk a tkání in vitro
1885 ­ ROUX, kuřecí embryonální buňky v solném roztoku1885 ­ ROUX, kuřecí embryonální buňky v solném roztoku
1940 ­ EARLE, první kontinuálně kultivovaná linie, buňky myší pojivové ---------tkáně,
jejím subklonem je dnešní linie L929
Provozování tkáňových kultur spočívá v zajištění
optimálních podmínek pro růst a přežívání
kultivovaných buněk / tkání!
(Pro jednoduchost se dále budou uvažovat jen buňky, problematika
tkání a orgánů bude doplněna na závěr.)
FYZIKÁLNÍ, CHEMICKÉ a BIOLOGICKÉ faktory, které je
třeba regulovat za běžných laboratorních podmínek.třeba regulovat za běžných laboratorních podmínek.
TEPLOTA
Buňky se kultivují při optimální teplotě pro organismus, z kterého byly
izolovány. Pro buněčné linie odvozené od člověka a běžných
laboratorních zvířat (myš, krysa, makak, pes,..) je to většinou 37oC. Prolaboratorních zvířat (myš, krysa, makak, pes,..) je to většinou 37oC. Pro
buněčné linie odvozené od poikilotermních živočichů (ryby, hmyz,
háďátko - Caenorhabditis) od 10 do 25oC.háďátko - Caenorhabditis) od 10 do 25 C.
Na CHEMICKÉ faktory lze nahlížet jako na média (jejichNa CHEMICKÉ faktory lze nahlížet jako na média (jejich
komponenty) v kterých buňky rostou a plyny, které tato
média obklopují případně jsou v nich rozpuštěny.
Složení médiíSložení médií
Veškeré komponenty použité pro přípravu médií musí být vysoké kvality, s minimem
nežádoucích příměsí (minimální chemická čistota p.a. ­ pro analýzu)
Základem je voda a v ní rozpuštěné anorganické soli. Soli jsou zdrojemZákladem je voda a v ní rozpuštěné anorganické soli. Soli jsou zdrojem
nezbytných iontů, a hrají významnou úlohu v zajištění vhodného pH (optimium
většinou 7.2-7.4) a osmotického tlaku / Osmomolarita (optimum většinou 280-většinou 7.2-7.4) a osmotického tlaku / Osmomolarita (optimum většinou 280-
320 mOsmol/L). Nejzákladnější ionty obsažené v médiích jsou: Na+, K+, Mg2+,
Ca2+, Cl-, SO4
2-, PO4
3-, HCO3
-.
Osmotický tlak je roven koncentracím rozpuštěných iontů/molekul
1 M NaCl = 1 Osm/L Na+ + 1 Osm/L Cl- = 2 Osm/L
1 M CaCl2 = 1 Osm/L Ca2+ + 2 Osmol/L Cl- = 3 Osm/L1 M CaCl2 = 1 Osm/L Ca2+ + 2 Osmol/L Cl- = 3 Osm/L
1 M glukósy = 1 Osm/L
Esenciální látky pro růst buněk
Média musí také obsahovat sacharidy (většinou glukózu, jako zdroj energie),
aminokyseliny (esenciální i neesenciální), vitaminy a stopové prvky.aminokyseliny (esenciální i neesenciální), vitaminy a stopové prvky.
Většina zejména savčích buněk vyžaduje
Insulin (příjem glukózy) Transferin (příjem železa) Selen (nezbytný pro funkci
oxidačně-redukčních enzymů)oxidačně-redukčních enzymů)
Další doplňkyDalší doplňky
Lipidy (mastné kyseliny), steroidní látky, hormony, cytokiny, peptidy, proteinyLipidy (mastné kyseliny), steroidní látky, hormony, cytokiny, peptidy, proteiny
extracelulární matrix, proteiny séra, nukleosidy,... Mnohé z těchto látek jsou
suplovány přídavkem séra (5 - 10 - 20%), v některých případech i jinými zdroji
málo charakterizovaných směsí proteinů a dalších látek. Významnými doplňkymálo charakterizovaných směsí proteinů a dalších látek. Významnými doplňky
jsou ochranné látky jako 2--merkaptoetanol (snižuje oxidativní stres a může
sloužit i jako zdroj síry) a antibiotika (ochrana proti mikroorganismům
případně selekční agens)případně selekční agens)
SérumSérum
- nejčastěji bovinní fetální*, ale i jiné zdroje
- lidské, koňské, kozí, myší,...- lidské, koňské, kozí, myší,...
- novorozenecká, dospělá
*fetální => nízká hladina nízkoafinitních imunoglobulinů (protilátek)*fetální => nízká hladina nízkoafinitních imunoglobulinů (protilátek)
- různé stupně kvality
- testy na přítomnost endotoxinů- testy na přítomnost endotoxinů
- testy na snášenlivost konkrétním typem buněk
- testy na přítomnost virů
- .....
- různé země původu (USA, Austrálie,...)
- různé šarže (lot number)
normální x inaktivní sérum
- inaktivace séra = 30 (45) minut při 56 °C- inaktivace séra = 30 (45) minut při 56 °C
pH
Při přípravě je pH médií je nastaveno/doladěno HCl (1M) a NaOH (1M).
pH
Při přípravě je pH médií je nastaveno/doladěno HCl (1M) a NaOH (1M).
pH v kultuře se mění v důsledku metabolismu buněk, zejména produkcí
laktátu a COlaktátu a CO2
V průběhu kultivace je udržováno:V průběhu kultivace je udržováno:
1) Přítomnými ionty, zejména fosfátovými (z fosforečnanů)
2) Proteiny s pufračními schopnostmi2) Proteiny s pufračními schopnostmi
3) Systémem H2CO3 / CO2
4) Alternativně silně pufrujícími látkami jako je HEPES, BES, TES4) Alternativně silně pufrujícími látkami jako je HEPES, BES, TES
K orientační detekci pH média v kultuře slouží fenolová červeň
přidávaná do médií.přidávaná do médií.
< 6 7 < 8
pH
Pufrační systém H CO / COPufrační systém H2CO3 / CO2
(NaHCO3)
CO2 + H2O = H2CO3 = H+ + HCO3
-CO2 + H2O = H2CO3 = H + HCO3
http://www2.biomed.cas.cz/d331/vade/ph.html
Kultivace : otevřená ­ s výměnou plynů (zejména přísun CO2 z vnějšku)
uzavřená ­ bez výměny plynů (používá se ~  množství NaHCO3)
- Při otevřeném systému kultivace se nejčastěji udržuje atmosféra s- Při otevřeném systému kultivace se nejčastěji udržuje atmosféra s
navýšeným obsahem CO2, standardně 5% CO2 (regulovaný přísun ze
zásobní bomby) a 95% vody (regulovaný přísun, nebo častějizásobní bomby) a 95% vody (regulovaný přísun, nebo častěji
spontánním odparem ze zásobníku.
V některých speciálních případech je vhodné použít
polotekutá až pevná médiapolotekutá až pevná média
Takové médium se připraví přídavkem:
- Agaru (je třeba dávat pozor na přehřátí složek média během přípravy,
teplota by neměla být vyšší jak 40oC)teplota by neměla být vyšší jak 40oC)
- Metylcelulósy
- Fibrinogenu (po aktivaci -> fibrin / fibrinová síť)
- je možné použít i čistě syntetické polymery, např. metakryláty (hydrogely)
Trvanlivost a uchování médií a jejich doplňkůTrvanlivost a uchování médií a jejich doplňků
!doporučení výrobce ­ dodavatele!!doporučení výrobce ­ dodavatele!
- Solné roztoky jsou stabilní i při R.T. (room temperature ~ 20oC)- Solné roztoky jsou stabilní i při R.T. (room temperature ~ 20 C)
- Většina složek média (aminokyseliny, vitaminy, sacharidy,..) je
stabilní po dobu jednoho roku při 4oC a tmě
- Glutamin v roztoku se nejpozději po 3 měsících začne rozkládat = je- Glutamin v roztoku se nejpozději po 3 měsících začne rozkládat = je
třeba ho přidávat samostatně ze zamražéné zásoby. Jeden rok při 4oC
se ale ješte považuje za akceptovatelný, možno nahradit médii s
Glutamax a pod.Glutamax a pod.
- Sérum při 4oC až 2 měsíce, při -20oC až 3 roky
- Obecně při teplotách pod -70oC je vše stabilní minimálně 1 rok- Obecně při teplotách pod -70oC je vše stabilní minimálně 1 rok
- Stabilita je závislá na tekutosti / zmrzlosti roztoku, což je ovlivněno
složením a koncentrací rozpuštěných komponent. Např. soli a glycerol
posouvá bod tuhnutí k nižším teplotám (při -20oC není 10% roztok
glycerolu úplně zmrzlý) a DMSO k vyšším teplotám (tuhne už při ~
+6oC)+6 C)
Biologické faktory ­ v kultuře roste ještě něco navíc nežBiologické faktory ­ v kultuře roste ještě něco navíc než
požadujeme = čistota kultury / sterilita
- Jiné buněčné linie (zkreslení výsledků buněčnou specializací,
dominance invazní buněčné linie = zánik původní buněčné linie)
- Plísně, kvasinky, bakterie (toxiny, vyčerpání média = zkreslení
výsledků, úhyn buněk, ohrožení experimentátora)výsledků, úhyn buněk, ohrožení experimentátora)
- Viry (zkreslení výsledků, úhyn buněk, ohrožení experimentátora)- Viry (zkreslení výsledků, úhyn buněk, ohrožení experimentátora)
1. PREVENCE + MONITORING!
2. LÉČENÍ
PREVENCE
PROVOZ
PREVENCE
PROVOZ
- Laboratoř TC (LTC) je pokud možno oddělená od ostatních prostor,- Laboratoř TC (LTC) je pokud možno oddělená od ostatních prostor,
nevětrá se přímo okny, ale pokud možno přes ventilační systém s
filtracífiltrací
- Pravidelně se provádí úklid a desinfekce povrchů (prostředky na bázi
chloru ­ SAVO, Jodu ­ Ajatin, 70% EtOH,....)chloru ­ SAVO, Jodu ­ Ajatin, 70% EtOH,....)
- LTC je periodicky vysvěcována germicidní (širokospektré UV) lampou
- Pracovníci LTC používají pracovní oblečení určené jen pro LTC a před- Pracovníci LTC používají pracovní oblečení určené jen pro LTC a před
vlastní prací si desinfikují ruce příslušnými prostředky (minimálně
použití 70% EtOH)
- S kulturami se pracuje pokud možnou pouze ve Flow-boxu
MATERIÁL
Čisté materiály se podle své odolnosti / vlastností sterilizují:
(čistý z čistých surovin nebo po důkladném omytí speciálními detergenty)
autoklávováním (120oC, 20-30 minut)
­ solné roztoky, některé pufry, agar, želatina/kolagen, některý plastik,..
suchým teplem (180oC, 3 až 4h)suchým teplem (180 C, 3 až 4h)
­ sklo, vzácně některý plastik (do 120oC)
zářením gama (vzácně i UV ­ jen povrchy)
­ plastik, sklo­ plastik, sklo
filtrováním
- vzduch (HEPA filtry s póry 0,3 m), roztoky hlavně média a séra běžně přes
filtry s póry 0,2 m)filtry s póry 0,2 m)
omytím (2-5% aldehydy, 70% EtOH, 2-5% fenol, 5-10% peroxid vodíku,....)
­ nástroje, pracovní plochy, některý plastik, sklo (celkově může být málo
účinné a požkozující čištěný materiál)účinné a požkozující čištěný materiál)
plamenem
-kovy, sklo-kovy, sklo
parami alkylačních činidel
- někdy kombinace s autoklávováním (etylén oxid), speciální aplikace jako
dekontaminace filtrů flow-boxů, dekontaminace místností (formaldehyd), vždydekontaminace filtrů flow-boxů, dekontaminace místností (formaldehyd), vždy
problém pro obsluhu!
Významným prevenčním agens v médiích jsou antibiotika.Významným prevenčním agens v médiích jsou antibiotika.
Kritéria pro antibiotika:Kritéria pro antibiotika:
- nesmí inhibovat růst a ani ovlivňovat metabolismus buněk
- musí ochraňovat kulturu po celou dobu experimentu- musí ochraňovat kulturu po celou dobu experimentu
- netoxické a bezpečné pro uživatele
- kompatibilní s ostatními složkami média
- rozpustné v netoxických rozpouštědlech- rozpustné v netoxických rozpouštědlech
a) Ochranné proti mikroorganismům
Nejčastěji penicilin/streptomycin nebo gentamycin, příležitostně tetracyklin
b) Selekční (viz. Příprava transgenních linií)
Neomycin (G418, geneticin), Hygromycin, Puromycin
c) Speciální
Mitomycin C
Přehled nejčastěji používaných antibiotik
G+ ... grampozitivní bakterieG+ ... grampozitivní bakterie
G- ... gramnegativní bakterie
IP ... inhibuje proteosyntézu
ISBS ... inhibuje syntézu bakteriální stěny
MONITORING
- V kultuře nebo v zásobních rostocích něco roste co tam nemá být
(plísně = chomáčky; kvasinky = pučící buňky, řetízky; bakterie = drobné útvary,(plísně = chomáčky; kvasinky = pučící buňky, řetízky; bakterie = drobné útvary,
kulovité až vláknité, někdy řetízky)
- Dochází k rychlému vyčerpání média (rychle mění barvu z červené na- Dochází k rychlému vyčerpání média (rychle mění barvu z červené na
žlutou = pokles pH)
- Buňky špatně rostou, nemají správný tvar, adherentní se pouští podkladu- Buňky špatně rostou, nemají správný tvar, adherentní se pouští podkladu
- Mikroskopické barvení na celkovou DNA (zviditelnění mikroorganismů,
zejména endoparaziti)zejména endoparaziti)
- Stanovení specifických antigenů (Imunocytochemie, western blot)
- Detekce specifických sekvencí pro jednotlivé organismy PCR metodou- Detekce specifických sekvencí pro jednotlivé organismy PCR metodou
- Kontrolní kultivací médií samotných nebo po přídavku specifických
substrátů
- Výsledky experimentů nejsou reprodukovatelné / jsou chaotické
- Buňky jsou citlivější ke stresu
LÉČENÍLÉČENÍ
- Likvidace zasažené kultury- Likvidace zasažené kultury
- Kombinací antibiotik
- Kultivací buněk v kompatibilním organismu- Kultivací buněk v kompatibilním organismu
(např. v břišní dutině = ascites)
??
Chomáček plísně v kultuře
Mycoplasmata
- Běžným VIS mikroskopem prakticky nejsou vidět
- Intracelulární bezestěné bakterie (trojvrstevná cytoplasmatická membrána)
Mycoplasmata
- Intracelulární bezestěné bakterie (trojvrstevná cytoplasmatická membrána)
DETEKCE (je třeba kukltivovat bez antibiotik ­ možné přežívání na pozadí):
- Vitální barvení na DNA (Hoechst)- Vitální barvení na DNA (Hoechst)
- Detekce specifických DNA sekvencí pomocí PCR
- In situ hybridizace (RNA , DNA)
- Měření enzymatické aktivity, systémy s transgenními buňkami (fy. Invivogene,...)
- (Inkorporace uracilu (mycoplasmata) X uridinu (eukaryontní buňky))
ZDROJE:
- infikované buňky v TC!
- práce se zvířaty v laboratoři TC
- pracovníci laboratoř TC
LÉČENÍ:
- Kombinací antibiotik
- Pasážováním buněk v kompatibilním organismu (ascites ­ volně v břišní dutině)
Viabilita některých druhů mycoplasmatViabilita některých druhů mycoplasmat
za různých podmínek
Obecné schéma léčení buněčných linií v LTK na mycoplasmata
Příklad postupu léčení buněčné kultury na mycoplasmata
přípravkem BM-cyclin fy Rochepřípravkem BM-cyclin fy Roche
Účinnost komerčně dostupných antibiotik
v léčení kultur napadených mycolpasmatyv léčení kultur napadených mycolpasmaty
Uphoff & Drexler 2001
n ­ počet testovaných buněčných linií
Zdravá buněčná kultura Buněčná kultura infikovanáZdravá buněčná kultura Buněčná kultura infikovaná
mycoplasmaty
(vitální barvení pomocí Hoechst 33258)
MycoAlert Mycoplasma
MycoZapTM Mycoplasma
MycoAlert Mycoplasma
Detection Kit MycoZapTM Mycoplasma
Elimination Reagent
Základní vybavení laboratoře tkáňových kulturZákladní vybavení laboratoře tkáňových kultur
Inverzní mikroskop
CO2 inkubátor
Inverzní mikroskop
Flow-box / laminární box - základníFlow-box / laminární box - základní
Flow-box / laminární box ­ biohazard,
Průtokový cytometr
Počítač částic
Průtokový cytometr
/ Flow-cytometer (FACS)
Počítač částic
- Inkubátor / termostat s regulací teploty a složení atmosféry
- Flow-box- Flow-box
- Inverzní mikroskop, nejlépe s fázovým kontrastem (Nomarského vnitřní
struktura buněk; Hoffmanův (reliéfní) ­ plastickévnitřní struktura buněk; Hoffmanův (reliéfní) ­ plastické
znázornění povrchů)
- Počítač částic (hemocytometr, Bürkrova komůrka, Coulter Counter,
FACS,..)FACS,..)
- Lednice a mrazáky
- Kontejner s tekutým N (-196oC), nebo extrémně hluboko-mrazící- Kontejner s tekutým N2 (-196oC), nebo extrémně hluboko-mrazící
box (-150oC a méně)
- Autokláv (parní sterilizátor), horkovzdušný sterilizátor- Autokláv (parní sterilizátor), horkovzdušný sterilizátor
- Centrifuga
- Pipetor / Pipetus (manuální nebo elektronický)- Pipetor / Pipetus (manuální nebo elektronický)
- Automatické pipety
- Technické zázemí ­ umývárna, sklad, šatna,...- Technické zázemí ­ umývárna, sklad, šatna,...
BUŇKY V TC
Podle způsobu kultivace
BUŇKY V TC
- Adherentní (většina, rostou přichyceny k podkladu)
- Suspenzní (zejména buňky krve a jejich deriváty, volně se vznášejí v médiu)- Suspenzní (zejména buňky krve a jejich deriváty, volně se vznášejí v médiu)
Podle původu a vlastnostíPodle původu a vlastností
- Primokultury
Buňky izolované většinou ze zdravé tkáně
(obecně zdravý genom, ale většinou omezené možnosti kultivace/dělení buněk)
- Permanentní linie
Nejčastěji buňky izolované z nádorů, ale mohu být i ze zdravé tkáně, případněNejčastěji buňky izolované z nádorů, ale mohu být i ze zdravé tkáně, případně
ze zdravé tkáně a imortalizované (většina chyby v genomu -> nestabilita,
jsou ale nesmrtelné), adaptace na podmínky in vitro!!!
PRIMOKULTURY PERMANENTNÍ LINIE
heterogení klonheterogení klon
omezená životnost (H.l.) nesmrtelné
Většinou náročnější na
kultivaci
Obecně snadno
kultivovatelné
variabilita izolací genetická nestabilitavariabilita izolací genetická nestabilita
BUŇKY
NORMÁLNÍ IMORTALIZOVANÉ NÁDOROVÉ
diploidní diploidní / aneuploidní diploidní / aneuploidnídiploidní diploidní / aneuploidní diploidní / aneuploidní
/polyploidní
senescence / Hayflick limit nesmrtelnost nesmrtelnost
Růst závislý na kontaktu s
podložkou
(anchorage-dependent)
Růst závislý na kontaktu s
podložkou
(anchorage-dependent)
Růst je nezávislý na
kontaktu s posdložkou
(anchorage-independent)(anchorage-dependent) (anchorage-dependent)
+++/- specifické růstové
faktory
+/- specifické růstové
faktory
+/--- specifické růstové
faktoryfaktory faktory faktory
netvoří nádory netvoří nádory tvoří nádory
RŮST BUNĚK V TC
A) Buňky se v kultuře nedělí ­ je třeba periodicky měnit kultivační médium
RŮST BUNĚK V TC
A) Buňky se v kultuře nedělí ­ je třeba periodicky měnit kultivační médium
(terminálně diferencované, postmitotické buňky)
B) Buňky se v kultuře dělí = proliferují ­ je třeba je pasážovatB) Buňky se v kultuře dělí = proliferují ­ je třeba je pasážovat
(většina buněk primokultur i permanentních linií)
Pasážování ­ periodické ,,ředění buněk", obecně spojené i s výměnou média
Adherentní linie* ­ mechanicky nebo enzymatickým štěpením vazeb buňky / substrát;
buňka / buňka
Enzymy - trypsin, colagenáza,..; inaktivace spec. inhibitory, vyředěním,
nadbytkem proteinů (např. sérem)
Podpůrné látky ­ EDTA (zejména vychytávání Ca2+)
Suspenzní linie ­ prostým ředěnímSuspenzní linie ­ prostým ředěním
* Ve většině případů je u adherentních linií nutno počítat s jejich zvýšenými nároky na kvalitu podkladu,* Ve většině případů je u adherentních linií nutno počítat s jejich zvýšenými nároky na kvalitu podkladu,
na kterém rostou. Běžně se používá ošetření 0.01 ­ 0.1 % roztokem želatiny (prasečí, hovězí) v dH2O.
Podle potřeby a typu buněk se používají ale i ostatní proteiny ECM.
Proliferaci buněk v kultuře charakterizuje růstová křivka s 3 fázemi
Početbuněk
Stacionární fáze
Početbuněk
Lag fáze
Logaritmická (růstová) fáze
Dále je buněčná proliferace charakterizována:
Čas
Lag fáze
Dále je buněčná proliferace charakterizována:
Buněčná - denzita ­ počet buněk na ml nebo cm2
- konfluence ­ počet buněk na plochu u adherentních linií (b. / cm2,- konfluence ­ počet buněk na plochu u adherentních linií (b. / cm2,
častěji ,,%" plochy)
Generační dobou - doba mezi dvěma mitózami / rozděleními buňky = délkaGenerační dobou - doba mezi dvěma mitózami / rozděleními buňky = délka
buněčného cyklu
Doubling time ­ čas potřebný ke zdvojnásobení buněk v populaci
Hayflickův limit ­ v případě většiny primokultur počet možných dělení, buněčněHayflickův limit ­ v případě většiny primokultur počet možných dělení, buněčně
specifické (senescence ­ stárnutí buněk, ,,quiescence klid/spánek
buněk")
Analýza buněčné proliferaceAnalýza buněčné proliferace
Počítáním buněk
- v mikroskopu (Bürkrova komůrka / hemocytometr)- v mikroskopu (Bürkrova komůrka / hemocytometr)
- přístroji (Coulter counter ­ počítač částic, FACS ­ potřeba vnitřního standardu)
Přírůstek v množství DNA (lze použít i pro jednotlivou buňku)Přírůstek v množství DNA (lze použít i pro jednotlivou buňku)
- Inkorporace 3H thymidinu (měří se přírůstek radioaktivity, celkový, nebo u jednotlivé buňky)
- Inkorporace BrdU (bromdeoxyuridinu, analog thymidinu), množství BrdU se stanoví
pomocí protilátky (lze na populaci i jednotlivé buňce)pomocí protilátky (lze na populaci i jednotlivé buňce)
- Celkové množství DNA v buňce -> stanovení fáze buněčného cyklu
Přírůstek celkových proteinůPřírůstek celkových proteinů
- nepoužitelné u buněk produkujících velké množství extracelulární matrix (ECM)
Stanovení enzymatické aktivity (enzymy permanentních metabolických drah)
- testy využívající tetrazoliové soli (např. MTT, WST-1), které jsou redukovány na barevné
formazany, které se dají stanovit spektrofotometricky (různé tetrazoliové soli jsou různěformazany, které se dají stanovit spektrofotometricky (různé tetrazoliové soli jsou různě
citlivé pro jednotlivé enzymatické (oxidačně redukční, NADP) systémy a i vhodné pro různé
typy buněk)
Stanovení exprese specifických proteinů spřažených s proliferací
- imunohistochemicky (jednotlivé buňky)
- western blotem (celkově v populaci)
(PCNA, Ki-67, cykliny, inhibitory na cyklinech závislých kináz (cyklin-dependentní kinázy),..
Nedílnou součástí sledování proliferační aktivity buněk je i detekce jejich životaschopnosti
= viability, která je spojená s buněčnou smrtí = apoptózou, případně s nekrózou
Analýza viability a apoptózy
A) Testy založeny na kompaktnosti zdravé buňky a jejím ,,správném" chování
- Morfologické změny (apoptická tělíska, výběžky, ...)- Morfologické změny (apoptická tělíska, výběžky, ...)
- Schopnost vylučovat barviva živými buňkami (eosin, bromfenolovou modř pro detekci ve
VIS, propidium iodid pro fluorescenci: mikroskopicky, FACS)
- Enzymatická aktivita, nejčasteji esterázy (fluorescein diacetát pro fluorescenci:
mikroskopicky, FACS, možno kombinovat s propidium iodidem)
- U adherentních buněk lze hodnotit počet adherovaných a plovoucích (mrtvých / apoptických
buněk
- Změny ve struktuře cytoplasmatické membrány -> anexin / fosfatidylseriny
B) Testy založeny na stanovení biochemických a molekulárně biologických parametrůB) Testy založeny na stanovení biochemických a molekulárně biologických parametrů
- Fragmentace DNA (elektroforeticky = tzv. apop. žebříček DNA, in situ = TUNEL test)
- Aktivita specifických proteáz = kaspásy, detekce fragmentace substrátů kaspás
- Hladiny pro- a anti-apoptických proteinů rodiny Bcl-2- Hladiny pro- a anti-apoptických proteinů rodiny Bcl-2
- Kompaktnost mitochondrií (změny v polarizaci m. membrány, vylití cytochromu c)
Diferenciace buněkDiferenciace buněk
V průběhu kultivace (pasážování) buněk se volbou vhodných podmínek snažíme,V průběhu kultivace (pasážování) buněk se volbou vhodných podmínek snažíme,
aby si buňky dlouhodobě zachovali stabilní genotyp i fenotym. Přitom u nádorových línií
je udržení stabilního genotypu už z principu problematické. Změny kultivačních podmínek
mohou vést k nestabilitě již tak obecně nestabilního geneotypu u nádorových linií,mohou vést k nestabilitě již tak obecně nestabilního geneotypu u nádorových linií,
ale vedou zejména ke změně fenotypu => diferenciaci, a to jak cílené tak náhodné.
DIFERENCIACE JE PRAKTICKY VŽDY SPOJENA I SE ZMĚNOU PROLIFERAČNÍCHDIFERENCIACE JE PRAKTICKY VŽDY SPOJENA I SE ZMĚNOU PROLIFERAČNÍCH
PARAMETRŮ, PŘÍPADNĚ I S APOPTÓZOU.
Parametry analýzy diferenciace:
- změny v morfologii buněk
- změny v expresi genů: detekce specifických mRNA a specifických proteinů
(v časných stádiích zejména transkripční faktory, později zejména strukturní proteiny a enzymy)(v časných stádiích zejména transkripční faktory, později zejména strukturní proteiny a enzymy)
- funkční testy (fagocyty ­ fagocytóza; nervy ­ přenos signálu, depolarizace membrány, produkce
mediátorů; svaly ­ odpověď na stimulus, kontrakce; epitely - produkce mucinů;.....; transplantace
a sledování jak se transplantované buňky zapojí do funkce dané tkáně)
Zdroje buněk v TCZdroje buněk v TC
A) Tkáňová banka nebo darem
např. American Tissue Culture Colection (www.atcc.com)
B) Příprava kmenů (populace) nebo klonů (z jednotlivé buňky) z nádorů
např. American Tissue Culture Colection (www.atcc.com)
B) Příprava kmenů (populace) nebo klonů (z jednotlivé buňky) z nádorů
Izolace nádoru, jeho enzymatická disociace na buněčnou suspenzi,
kultivace buněk ve vhodných podmínkách, selekce zajímavých kmenů, klonůkultivace buněk ve vhodných podmínkách, selekce zajímavých kmenů, klonů
a jejich charakterizace v průběhu kultivace -> linie musí vykazovat dostatečnou stabilitu
v průběhu kultivace, aby byla zachována reprodukovatelnost výsledků.
Popis nově získané linie by měl obsahovat co nejvíce její chrakteristik.
Původ (typ nádoru, věk a pohlaví dárce, způsob získání, počet pasáží od jejího
ustanovení
C) Příprava primokultur z živočišných tkání
Příprava myších embryonálních fibroblastů
MEF ­ mouse embryonic fibroblastMEF ­ mouse embryonic fibroblast
PEF ­ primordial embryonic fibroblast
- Připravují se nejčastěji z 13.5 denních embryí (11-13.5 dpc.)
- Gravidní samice se usmrtí a vypreparuje se děloha s embryi
- Z embryí se odstraní hlava a vnitřní orgány- Z embryí se odstraní hlava a vnitřní orgány
- Zbytek embrya se enzymaticky a mechanicky rozruší a po odstranění
kompaktních zbytků, se suspenze vyseje na kultivační misku
- Rozrostlé buňky se zamrazí (pasáž 0) a nebo se dále kultivují- Rozrostlé buňky se zamrazí (pasáž 0) a nebo se dále kultivují
(~6-15 pasáží ~ 24-60 dnů, Hayflick limit)
Příprava stromálních buněk kostní dřeněPříprava stromálních buněk kostní dřeně
BMSC ­ bone marow stromal cells
- Vypreparujeme stehenní kost, odstřihneme hlavice a propláchneme
(např. injekční stříkačkou) vhodným kultivačním médiem do kutivační misky( ) vhodným kultivačním médiem do kutivační misky
(lze i kost navrtat a odsát (např. injekční stříkačkou) = možné autotransplantace).
- Po 24 hodinách kultivace odstraníme médium se zbylými krevními elementy
opláchneme a přidáme nové.opláchneme a přidáme nové.
- Stromální buňky postupně vytváří nepravidelné kolonie fibroblastům
podobných buněk
- Standardně je lze kultivovat minimálně 2-3 týdny- Standardně je lze kultivovat minimálně 2-3 týdny
Pozn. potkaní a lidské rostou lépe jak myší
Příprava myších ES buněk
ES ­ embryonic stem, embryonální kmenové
3,5 dní p.c. 4-5 dní3,5 dní p.c.
ICM
4-5 dní
Fibroblastová výživná vrstva
TE Vyseknutí a
disociace ICM
Fibroblastová výživná vrstva
,,feeder"- tvořená MEF
Odstranění
PEF
Linie ES buněk na feederu MEF Homogenní populace ES buněk
Upraveno podle Kroupová 2004
Dlouhodobé uchování buněčných linií v TC
Permanentní kultivace
- selekce buněk s odlišnými vlastnostmi než měly ty původní
- časově a finančně náročné
* Empiricky je za stabilní považováno 10 ­ 30 pasáží v závislosti naˇ Empiricky je za stabilní považováno 10 ­ 30 pasáží v závislosti na
buněčné linii a i na kultivačních podmínkách.
* Nádorové linie jsou obecně méně stabilní (poškozený genotyp) nežˇ Nádorové linie jsou obecně méně stabilní (poškozený genotyp) než
primokultury (zde ale nevýhoda Hayflickova limitu).
* Výjimkou se v současné době zdají být myší ES buňky, u kterých jsouˇ Výjimkou se v současné době zdají být myší ES buňky, u kterých jsou
známy kultivační podmínky, kdy dlouhodobě (> 100 pasáží) v zásadě
nemění své vlastnosti.
Zamražování buněkZamražování buněk
Obecně v kultivačním médiu
a) se zvýšeným obsahem séra (20-100%)a) se zvýšeným obsahem séra (20-100%)
b) se sérem (10-20-50%) s přídavkem DMSO (5-10%)
c) vzácně se sérem (10-20-50%) a přídavkem glycerolu (10%)
Buňky je třeba zchlazovat postupně na ~ -80oC, poté se přenesou do
ultra-hlubokomrazícího boxu (~ -185oC) nebo do tekutého N2 (-196oC)
k trvalému uchování. Je vhodné pro zamražení používat vysokék trvalému uchování. Je vhodné pro zamražení používat vysoké
koncentrace buněk ~ >107 buněk na ml média.
Postupné zchlazování
- V lázni s isopropylalkoholem (R.T.), přenos přímo do hlubokomrazícího- V lázni s isopropylalkoholem (R.T.), přenos přímo do hlubokomrazícího
boxu (~ -80oC), teplota klesá rychlostí ~ 1oC za 1 minutu
- Zanořováním do par N2
- V termoisolačním materiálu (např. pěnový polystyren) přímo do- V termoisolačním materiálu (např. pěnový polystyren) přímo do
hlubokomrazícího boxu, po 1-3 dnech k trvalému uchování
- V termoisolačním materiálu na ~ 2-4h do mrazícího boxu (-20oC), pak na- V termoisolačním materiálu na ~ 2-4h do mrazícího boxu (-20 C), pak na
1-3 dny do hlubokomrazícího boxu, následně k trvalému uchování
Rozmražování buněk
Buňky je třeba rychle převést z hlubokého zamražení (~ 190oC) na kultivační teplotu,
opláchnout zamražovací médium (centrifugací) a vyset k další kultivaci. Druhý den
po vysetí je vhodné vyměnit kultivační médium za nové a odstranit tak zbytky buněk,
které zamražení/rozmražení nepřežily.
Kryo-zkumavky
Dewarovy nádoby
Přeprava buněkPřeprava buněk
- V zamraženém stavu v tekutém N (v termosce, lokální přeprava)- V zamraženém stavu v tekutém N2 (v termosce, lokální přeprava)
- V zamraženém stavu v isolačním boxu se suchým ledem (CO2)
(na velké vzdálenosti, zásilkové společnosti mývají i službu s doplňováním
suchého ledu)suchého ledu)
- Živé v kultuře, v kultivační nádobce s nadbytkem média
(v závislosti na buněčném typu 1 ­ 3 dny)
- Tkáně (s výjimkou krve) se přepravují podchlazené (ne zmrzlé)
ve výživných médiích, často s kryo-protektivyve výživných médiích, často s kryo-protektivy
Synchronizace buněk v buněčném cyklu
Fyzikální metody
- Setřásání mitotických buněk u adherentních kultur- Setřásání mitotických buněk u adherentních kultur
- Centrifugace (G0/G1 buňky jsou nejlehčí)
a) v gradientu
b) elutrace (centrifugace s protiproudem média)b) elutrace (centrifugace s protiproudem média)
- FACS, sortrování pomocí flow-cytometru
- Membránové vymývání (zdokonalená metoda setřásání)- Membránové vymývání (zdokonalená metoda setřásání)
Chemické metody
- Deprivace růstovými faktory (sérem)
- Deprivace odstraněním iso-leucinu z média- Deprivace odstraněním iso-leucinu z média
- Deprivace Ca2+
- Přídavek hydroxyurei, inhibice RNA syntésy -> blok DNA syntézy
- Dvojitý thymidinový blok- Dvojitý thymidinový blok
- Mitotické jedy, inhibují reorganizaci mikrotubulů / dělícího
vřeténka (kolchicin, kolcemid, nocodazol, ...) ­ zejména
zviditelnění chromozomů, karyotipyzacezviditelnění chromozomů, karyotipyzace
Srovnání synchronizace v buněčném cykluSrovnání synchronizace v buněčném cyklu
deprivací sérem (A) a kontaktní inhibicí (B)
Příklad rozjezdu buněk synchronizovaných deprivací séremPříklad rozjezdu buněk synchronizovaných deprivací sérem
myší fibroblasty linie NIH/3T3
Princip dvojitého bloku přídavkem nadbytku thymidinu
- nadbytek thymidinu blokuje průchod S-fází buněčného cyklu, blokuje DNA syntézu- nadbytek thymidinu blokuje průchod S-fází buněčného cyklu, blokuje DNA syntézu
Elutrační kyveta / hylzna
- separace buněk pomocí protiproudého gradientu
na speciální centrifuze - elutrátoruna speciální centrifuze - elutrátoru
Současná kultivace více buněčných typůSoučasná kultivace více buněčných typů
- Produkce růstových faktorů s parakrinním účinkem- Produkce růstových faktorů s parakrinním účinkem
- Vhodné mechanické vlastnosti podkladu atd.
V případě přímého kontaktu odlišení buněk na základě jejich vlastností
- Exprese specifických proteinových markerů na povrchu buněk
- Selekce díky expresi nějakého proteinu (enzymu, fluoreskujících proteinů,..
- Inhibice mitotické aktivity jednoho typu buněk (gama zářením, Mytomicinem C,..)- Inhibice mitotické aktivity jednoho typu buněk (gama zářením, Mytomicinem C,..)
Pokud je třeba maximálně minimalizovat riziko vzájemné kontaminace
- Buňky v kultuře jsou odděleny polopropustnými membránami
Imortalizace buněk
Proč?
- převedení primokultur v permanentní linie- převedení primokultur v permanentní linie
- zjednodušení kultivačních podmínek
a) Spontálně ­ pomalé, málo účinné
b) Cíleněb) Cíleně
- fyzickálními faktory: Gamma záření, Rentgenovo záření (záření X), teplota
- chemickými faktory: NiCl, NiSO4, Dimethylsulphate, N-methyl-N-nitrosouera (MNU),
benzo[a]pyrene diol epoxide, 4-nitroquinoline 1-oxide (4NQO)
- biologickými faktory: viry - virus Epstein Barrové, virus myší leukemie,
virus Rousova sarkomu, SV40virus Rousova sarkomu, SV40
vektory (plasmidy / viry) exprimujícími transformující
protein, např. antigen SV40 large T nebo adenovirus E1A,..
Cílené genetické manipulaceCílené genetické manipulace
Změny genetické informace, vložením, poškozením nebo vypnutím genu / genů
- Vektory plasmidové a virové
- Chemicky nebo fyzikálně ­ viz. imortalizace
Vnesení vektoru do buněk
a) Infekcí ­ viry
b) Chemickyb) Chemicky
- lipofekce: obalení vektoru s lipidy a fúze komplexu s cytoplasmatickou
membránou
- Ca2+ precipitace: vysrážení vektoru na povrchu buněk v komplexu s Ca2+ a
jeho pohlcení buňkou endocytózou
- transfekce pomocí dextranu: komplex vektor / dextran spojený- transfekce pomocí dextranu: komplex vektor / dextran spojený
diethylaminoethylem je endocytován do buňky
- transferofekce: vektor je navázán na transferin a přes transferinový
receptor endocytován do buňkyreceptor endocytován do buňky
c) Mikroinjikace
d) Elektroporace - narušení buněčné membrány elektrickým výbojem a difůze
vektoru do buňkyvektoru do buňky
e) Nucleofekce - elektroporace v kombinaci s chemií
f) Biolisticky ­ vektor navázaný na partikuli (zlato, wolfram) je vstřelen do
tkáně, buněktkáně, buněk
Selekce buněčných klonů
Adherentní buňky pod selekčním antibiotikem, při dostatečné nízkéAdherentní buňky pod selekčním antibiotikem, při dostatečné nízké
účinnosti transfekce nebo jejich konfluenci tvoří samostatné kolonie, které lze
mechanicky, případně za pomoci proteáz (trypsin, kolagenáza) oddělit
Suspenzní buňky pod selekčním antibiotikem je třeba rozklonovat mezním
ředěním (někdy potřeba i u adherentních), nebo růstem v polotekutém /ředěním (někdy potřeba i u adherentních), nebo růstem v polotekutém /
viskózním médiu (agar apod.)
Nejběžnější selekční antibiotika pro savčí buňky
G418 / Neomycin, Hygromycin B, Puromycin
Dodatek ­ TKÁNĚ a ORGÁNY
Tkáně umíme kultivovat / připravovat jen velice omezeně, většinou jde pouze o
uchování po určitou dobu, podobně jako orgány.
U orgánů je již aktuální otázka přívodu živin, kyslíku a odvodu metabolitů a CO2.
Orgány je tedy třeba mít metabolicky utlumeny (podchlazením) a nebo napojeny na
oběh s živinami simulující krevní zásobení.oběh s živinami simulující krevní zásobení.
V současné době je zvládnutá problematika krve (lze zamrazit), částečně pak
epidermis / kůže a jaterní tkáně. Intenzivně se studují možnosti využití buněkepidermis / kůže a jaterní tkáně. Intenzivně se studují možnosti využití buněk
pankretu (Langernhansových ostrůvků) z prasat. Velkým příslibem pro
transplantace jsou také buňky a tkáně připravené z kmenových buněk.transplantace jsou také buňky a tkáně připravené z kmenových buněk.
Epidermis ­ primokultury prasečích / lidských keratinocytů pěstované na
syntetických nosičích se používají k regeneraci poškození epidermis posyntetických nosičích se používají k regeneraci poškození epidermis po
popáleninách apod.
Částečné úspěchy jsou při přípravě umělých jater, kdy separované hepatocytyČástečné úspěchy jsou při přípravě umělých jater, kdy separované hepatocyty
jsou vysety do reaktoru na rozvodné potrubí z polopropustných membrán. Celý
takový bioreaktor pak připomíná skutečná játra s krevní oběhem a odvodem žluči.
Hepatocyty se zatím nedaří dostatečně efektivně zamražovat k dlouhodobémuHepatocyty se zatím nedaří dostatečně efektivně zamražovat k dlouhodobému
uskladnění.
Doporučená literatura:Doporučená literatura:
Lesko, J. a kol.: Práce s tkanivovými kulturami, Bratislava, Vydavatelstvo slovenskej akademie ved
1975, s. 212.
Alberts, B. a kol.: Základy buněčné biologie. Úvod do molekulární biologie buňky. Ústí nad Labem,Alberts, B. a kol.: Základy buněčné biologie. Úvod do molekulární biologie buňky. Ústí nad Labem,
Espero Publishing 1998, 630 s.
Alberts, B. a kol.: Molekular biology of the cell. New York & London, Garland Publishing, Inc. 1994,
1294 s.
Spector, D. L. a kol.: Cells. A laboratory manual. Volumes 1, 2, 3. New York, Cold Spring Harbor
Laboratory Press 1998, 3 197 s.
Cellis, J. E. a kol.: Cell Biology. A laboratory handbook. San Diego, London, Academic Press Inc.
1994, 1714 s.1994, 1714 s.
Sambrook, J. a kol.: Molecular Cloning. A laboratory manual. New York, Cold Spring Harbor
Laboratory Press 1989, 1832 s.
Ausubel, F. a kol.: Short Protocols in Molecular Biology. USA, Published by John Wiley & Sons Inc.Ausubel, F. a kol.: Short Protocols in Molecular Biology. USA, Published by John Wiley & Sons Inc.
1995, 728 s.