Poškození biologicky důležitých makromolekul ca Poškození Následky nenasycené mastné kyseliny v lipidech ztráta dvojných vazeb, tvorba reaktivních metabolitů (peroxidy, aldehydy) změněná fluidita lipidů, změny v propustnosti membrán, vliv na membránově vázané enzymy, tvorba chemoatraktivních látek pro makrofágy proteiny agregace a síťování, fragmentace a štěpení, modifikace thiolových skupin a benzenových jader aminokyselin, reakce s hemovým železem změny v transportu iontů, vstup Ca2+do cytosolu, změny v aktivitě enzymů DNA štěpení kruhu deoxyribózy, modifikace a poškození bází, zlomy řetězce, křížové vazby řetězců mutace, translační chyby, inhibice proteosyntézy + glykace a glykooxidace Poškození DNA o H-N H,N^ N' © N -N I H H NH7 O N^4 e 1 5 N H Hi o H H H O N' I H IV! H "H O H O N' H © CFL H HOCH OH HOCH0 I - adenin II- guanin III - cytosin IV - uracil (pouze v RNA) V - thymin (pouze v DNA) VI - D-ribóza (pouze v RNA) VII - 2-deoxy-D-ribóza (pouze v DNA) A adenine C cytosine G guanine T thymine P phosphate S deoxyribose (sugar) ©1 998 Encyclopaedia Britannica, Inc. Nukleosid - báze připojená k cukru Nukleotid - báze + cukr + fosfát DNA je stabilní molekulou, v průběhu času však dochází ke spontánním změnám Příklad spontánních změn: Ztráta purinů („apurinic sites ") Cytosin může pomalu ztrácet aminoskupinu (deaminace) za vzniku uracilu Spontánní změny jsou opravovány reparačními mechanismy. Oxidatívni stres silně akceleruje poškození DNA Poškození DNA po expozici: reaktivním metabolitům kyslíku a dusíku ionizujícímu záření zvýšené koncentraci kyslíku aktivovaným fagocytům cigaretovému kouři ozonu xanthin oxidase DNA je poškozována reaktivními metabolity kyslíku i dusíku. Hydroxylový radikál - vysoce účinný a neselektivní: 1. reaguje s deoxyribózou (vyjmutí vodíku) - vzniká malondialdehyd a další produkty Důsledky - destrukce sacharidu a přerušení řetězce. To vede k aktivaci PARP (poly(ADP-ribose)polymerasa - enzymu vázaného na chromatin, který využívá NAD+ k nápravě zlomů). Nadměrná aktivace PARP = deplece NAD+= interference se syntézou ATP = buněčná smrt. 2. připojuje se k purinovým a pyrimidinovým bázím - mění je na hydroxyderiváty a oxoderiváty Důsledek - chybné párování bází při replikaci DNA a zavedení chyby do genetické informace Singlet Ový kyslík-negeneruje řetězcové zlomy, reaguje hlavne s guaninem Produkty LPO (RO*, ROO*) mohou poškozovat DNA Reaktivní metabolity dusíku mohou působit nitraci nebo deaminaci bází DNA Důsledky oxidativního poškození Modifikace baží vedou k mutacím. Příklad: RNS deaminují A na HX, C na U a G na X, což má za následek nesprávné párováni bází (např. správné párování A - T je nahrazeno HX - C) Excisní reparace Oxidované, deaminované nebo špatně spárované (mismatch) báze jsou odstraňovány podobným mechanismem. První typ = nukleotidová excisní reparace Chybný nukleotid je vystřižen nukleasou DNA polymerasa naváže správné nukleotidy podle neporušeného řetězce Následně DNA ligasa řetězec uzavře. Druhý typ = excizní reparace báze DNA glykosylasa hydrolyzuje vazbu abnormální báze na cukr-fosfátovou kostru Tím vzniká „AP site " (apurinic or apyrimidinic site) Dále je uvolněna AP-deoxyribóza působením AP lyasy na 3' a AP endonukleasy na 5' konci DNA polymerasa zaplní j ednonukleotidovou mezeru DNA ligasa uzavře řetězec DNA Reparace dvouřetězcových zlomů Vznikají působením ionizujícího záření (tvorba OH*) Náprava j e možná, aleje daleko těžší než ujednořetězcových zlomů, protože neexistuje intaktní řetězec. Nesprávné reparace vedou k velkým abnormalitám DNA známým jako chromozómové aberace. Poškození lipidů Peroxidace lipidu Tuky a oleje při skladování na vzduchu žluknou (autooxidační radikálová řetězová reakce) V biologických systémech tomuto procesu podléhají PUFAs, tj. polynenasycené mastné kyseliny s více dvojnými vazbami Tři fáze lipidové peroxidace První fáze = iniciace Hydroxy lovy radikál HO*, alkoxylový radikál RO* a peroxylový radikál ROO* Každá z těchto látek dokáže vytrhnout vodík z metylenové skupiny řetězce mastné kyseliny. Mastná kyselina nebo lipid se tak stává uhlíkovým radikálem (-*CH-) LH + HO* -> L* + H20 Druhá fáze = propagace Po vytržení vodíku se elektrony v uhlovodíkovém řetězci mastných kyselin uspořádají tak, že mezi dvěma dvojnými vazbami je jedna vazba jednoduchá (= konjugovaný dien). Tyto látky reagují s molekulárním kyslíkem za vzniku peroxylového radikálu (LOO*) L* + 02 -> LOO* LOO* je schopen vytrhnout elektron z mastné kyseliny sousedního lipidu, která se tak stává novým radikálem, zatímco LOO* se přemění na hydroperoxid (LOOH). LH + LOO* -> L* + LOOH Třetí fáze = terminace Radikálová reakce se v lipidech propaguje, dokud se radikál PUFA nesetká s jiným radikálem nebo s vitamínem E, kdy se řetězová reakce ukončí vznikem stabilní sloučeniny (terminace). Výsledkem lipidové peroxidace jsou: Hydroperoxidy mastných kyselin Cyklické endoperoxidy mastných kyselin Tyto peroxidy jsou poměrně stabilní, dokud se nesetkají s tranzitními prvky, které katalyzují Fentonovu reakci. V ní se lipidové peroxidy mění na alkoxylové radikály LO* a hydroxidový anion OH \ LOOH + Fe (II) [nebo Cu (I)] -> LO* + Fe (III) [nebo Cu (II)] + OH - fosfolipid odejmutí vodíku (elektron + proton) RH LH alkylový radikál ■■1 přeuspořádání molekuly konjugovaný dien alkyloveho radikálu ^1 příjem kyslíku peroxylový radikál R-] Ľ ,R2 LOO malondialdehyd alkenylový Ri (nebo alkanylový) radikál ° peroxylový radikál alkanaly alkenaly (4-HNE, MDA) modifikace biomoiekul alkeny alkany plíce V organismu probíhá: Neenzymová LPO Probíhá popsaným způsobem - reakcí s volnými radikály. Dává směs různých produktů: Etan, pentan - vydechujeme plícemi malondialdehyd (MDA), 4-hydroxynonenal (HNE) se navazují na proteiny a mění jejich životnost a funkci. Enzymová LPO Probíhá na aktivních centrech hydroperoxidáz a endoperoxidáz (cyklooxygenáza, lipoxygenáza) a produkuje biologicky aktivní látky důležité v řízení biologických dějů. Volné radikály nejsou v tomto případě uvolňovány z enzymu, a tak neškodí. ■iniM.'-n, kUACHIĽONiC ACID METABOLISM ^ AA* 5l8l ■//"# -eiooôaietmenoÍQ.a. -attlvates TSi NkC ( IFHg + ■ I Ol J sdhesi'on^promnoii'no fac-kr--in n&wtropk. & alveolar MJ2f k J^t> sC ■*■*' 's a - if «r» ktlivnii'on bu leaé<'nsi an-éľíens chemoŕay/'ľ). íe>í^č>k>I^Gt~es me — chanľca/x tiectn'eal SHim.uta-h'oft. VKC *"V PIA # VÄ fn n&wtrofk. & alveolar MJ2Í «, í/A -^ .tivrjSe' .* ,Ví tft .^ r&^^.-ep M^ \LBUKQTRIENBS\ «, jK^ /0S (farmed \-h „,.•„„ ^ (^Šřfs^T^, '______, ____ .. ._ K ■* Qr-anuloe.et ' monoay-ere^ inhibdec/ t>\. *^A^ —nosí íŕ/mu/a^eaŕ bo lipo- w^tr s/t; j-upeti- steroids (ifdu s+ii-niu/vte ike St/n-lhesfiz cf pr0h&>'n „ N Ihkc&i'Aons ofViA ' +^g ^pomocUthn tu1 inhlbihcL-Ž' . bu >fzt in aleraľes a. as-éhma bronchiiie.y neui'ropíiis (-epoxylipt'ck) b$ L\-b> p rodu z (.irreversibly inhibited muscle ivrxirazlcrj-y, A vasotvnstr, I Aŕ\ f Oil I-----ŕ--------- S/3Cnŕan.eoui| 1 ■C. , encbo-thel , , 1-------------------^-------------------, ' aoore, cGMTt I - I_____________________TV R ßiablP; ) Phospholipid <^ Uee also -'rttoptor-tytoot" inters. ,*^so££g\ "^2. \.,naíhvY HO N«^ H H OH D-glucose Aldehydy jsou chemicky reaktivní a mohou se vázat na aminoskupiny proteinů v procesu nazývaném neenzy matická glykace. Vzniká tzv. Schiffova báze. Zvýšená hladina glukózy v krvi vede k patologické hladině glykace. produkty ___ časné glykace i----r—•----•- "•----T-•----r INn2 || CH + hodiny | Hx//0 -5=^ (f°H)4 C' CH2OH (CHOH)4 CH2OH /protein + redukující^ ( Schiffova 1 cukr, např. glukóza J l báze Po určité době se Schiff o vy báze přeuspořádávají. Vzniká Amadoriho produkt. produkty _________^ přechodné časné glykace produkty glykace ^T~" ~T^~~ NH2 + NH -•- 1 NH ■*- dny —*- CH-, 1 2 C = 0 CH + hodiny | Hx//0 ^=^ (f0H)4 c' CH2OH (CHOH)3 (CHOH)4 Íh2OH CH2OH protein + redukující ^ í Schiffova ] (Amadoriho cukr, např. glukóza J l báze J l produkt Amadoriho produkt se dále během týdnů až měsíců mění na konečné produkty pokročilé glykace = Maillardovy sloučeniny neboli advanced glycation end products (AGE). AGE se mohou oxidovat kyslíkem za vzniku superoxidu a tudíž i dalších ROS. (Karboxymethyllysin a pentosidin jsou typické produkty oxidace AGEs). Glykaci tedy provází glykooxidace a oxidační stres. produkty ___ časné glykace _^ přechodné produkty glykace _^ produkty pokročilé glykace NH2 + hodiny I (CHOH)4 CH2OH NH II CH ■*• (CHOH) dny 4 <*- CH2OH (protein + redukující A f Schiffova 1 cukr, např. glukóza i { báze NH I z měsíce C=0 -I (CHOH). I 3 CH2OH Amadoriho produkt ^T^ ŕ produkty pokročilé glykace l svazující dva peptidové řetězce glycation -^ Glycated protein Glucose oxidation oxidation O, AGEs Reactive ~^ dicarbonyls protein " Lysine www o /\AAA/V\ NH ---CH----C -AAAAAj\ I (CH2)4 NH I CH2 COOH Carboxymethyl-lysine HN- Nt www HN N Arginine www Pentosidine Fig. 9.11. Glyoxidation reactions. The combination of glycation and oxidation can result in the formation of advanced glycosylation end-products (AGEs) whose increased accumulation appears associated with tissue injury in diabetes mellitus. Glucose can be oxidized before binding to proteins, or glycated proteins can themselves oxidize releasing ROS. Carboxymethyllysine (N6) and pentosidine have been identified as glycoxidation-derived constituents of AGEs, but there are many others. Fig. 9.9 shows formation of iV£-carboxymethyllysine from an Amadori product. Glykace mění vlastnosti modifikovaných proteinů Příklady negativního působení glykace: inaktivace SOD = zvýšený oxidatívni stres glykace apoB v LDL = změna náboje LDL částice a její vazba na scavenger LDL receptory makrofágů AGE jsou rozeznávány specifickými receptory na povrchu cévních a imunitních buněk a následně ovlivňují transkriční faktory a expresi genů cílových buněk AGE zvyšují syntézu adhezivních molekul na cévní stěně. Podporují adhezivitu monocytů a jejich průnik do cévní stěny. Tím podporují vznik aterosklerózy. Proteiny = významný cíl volných radikálů Řada aminokyselin je hydroxylována hydroxy lovým radikálem a nitrována peroxynitritem (tryptofan, fenylalanin, tyrosin) S proteiny reagují rovněž alkoxylové a peroxylové radikály vznikající při LPO OH* OH Phenylalanine RNS OH' r?rř/io-Tyrosine NOH meta-Tyrosine N02 3-Nitrophenylalanine R OH- OH OH Tyrosine HOCI / \ RNS OH DOPA Cl O' O O R R Tyrosyl radical NO. OH OH 3-Chlorotyrosine 3-Nitro tyrosine OH OH R R Bityrosine COOH COOH J ROS H Histidine -----N II ^N^O H 2-Oxohistidine Figure 4.27(a) + other products cocr I + H—C— NH. I 09N ^ N COO" 2 H j_j__q__nu ^^^""^ 6-Nitrotryptophan II XH Tryptophan /\ .CO—CH,—CH ľl ^T ^ M. COOH NH. NHCHO N- Formy 1 kynuren ine H20 HCOOH ex NH, COCH2-CH-COOH Kynurenine COOH I H7N-C—H 2 I CH. I 2 CH, I 2 S I CH3 Methionine ROS H.N COOH I C-H I CH. I 2 CH, I 2 s=o I CH. Sulphoxide COOH I H.N—C-H 2 I CH. I 2 CH, I 2 o=s=o I CH3 Sulphone R.-NH-CH-CO-R 1 I CH, I 2 CH, I 2 CH, I 2 NH C=NH I NH. R.-NH-CH-CO-R, Arginine Oxidation I CH, I 2 CH —OH I NH I C= I NH. NH NH, I 2 C = NH I NH. R,-NH-CH-CO-R~ 1 I l CH. I 2 CH, I 2 H-C = 0 Glutamyl semialdehyde R1-N-CH-CO-R2 Proline Oxidation ----------^ R1-N-CH-CO-R2 HO Figure 4.27. Some specific end-products of oxidative damage to amino-acid residues in proteins. Only selected products are sho'wn; many others are known. Důsledky poškození proteinů Změna enzymatické aktivity Změna iontové homeostáze buňky (porucha fukce transportních pump) V cytosolu se hromadí Ca2+ -> aktivace proteáz a fosfolipáz Vznik nových antigenních determiannt a nástup autoimunitních reakcí Změny v molekulární buněčné signalizaci 342 Oxidative stress: adaptation, damage, repair and death Oxidative sires s DNA da m.ige Poly(ADPnbose) synthetase activation NAD (H) depiction GSH depletion Inhibition of ATP synthesis Direct damage to proteins Rises in intracellular free iron/coppe» Increased lipid peroxidation GSH depletion Rises in intracellular free Ca2* Cytoskelcul damage Activation of NOS Membrane blebbing Pcroxynitritc formation Membrane peroxidation and destruction U Increased damage to DNA proteins, lipids Metal ion release into surrounding tissues, injury to adjacent cells Fig. 4.29. The multiple derangements of cell metabolism that can be caused by oxidative stress. Direct damage to UNA. proteins and/or lipids U possible. Secondary damage can arise when oxidative stress produces rises in 'free' intracellular metal ions, such as Ca *, Cu~* and Fc~ Ca3* can stimulate proteases and nucleases, damaging both DNA and the cyioskelcton as well 3% increasing NO* synthesis; excess NO" can inhibit mitochondrial energy generation and may lead to production of cytotoxic ONOO". Activation of calpains may lead to increased ROS production, e.g. by conversion of xanthine dehydrogenase to xanthine oxidase. Poškození biologicky důležitých makromolekul ca Poškození Následky nenasycené mastné kyseliny v lipidech ztráta dvojných vazeb, tvorba reaktivních metabolitů (peroxidy, aldehydy) změněná fluidita lipidů, změny v propustnosti membrán, vliv na membránově vázané enzymy, tvorba chemoatraktivních látek pro makrofágy proteiny agregace a síťování, fragmentace a štěpení, modifikace thiolových skupin a benzenových jader aminokyselin, reakce s hemovým železem změny v transportu iontů, vstup Ca2+do cytosolu, změny v aktivitě enzymů DNA štěpení kruhu deoxyribózy, modifikace a poškození bází, zlomy řetězce, křížové vazby řetězců mutace, translační chyby, inhibice proteosyntézy + glykace a glykooxidace