Volné radikály ve fyziologii živočichů RNDr. Milan Číž, Ph.D. RNDr. Antonín Lojek, CSc. Mgr. Lukáš Kubala, Ph.D. Laboratoř patofyziologie volných radikálů Biofyzikálni ústav Akademie věd CR Volné radikály ve fyziologii živočichů 1. Chemie volných radikálů, historie kyslíku na Zemi 2. Zdroje a tvorba volných radikálů 3. Antioxidační obranné mechanismy 4. Oxid dusnatý - tvorba a funkce 5. Fagocyty, myeloperoxidase NADPH oxidasy 6. Volné radikály ve fyziologických regulacích 7. Oxidatívni poškození biologicky důležitých molekul 8. Volné radikály a ateroskleróza 9. Úloha volných radikálů u vybraných nemocí 10. Volné radikály a stárnutí 11. Metody stanovení oxidativního stresu 12. Seminář Doporučená literatura Štípek S. a kol.: Antioxidanty a volné radikály ve zdraví a nemoci. Grada Publishing, Avicenum, 2000. Duračková Z. a kol.: Voľné radikály a antioxidanty v medicíne (1, 2). SAV Bratislava, 1998-1999. Halliwell B.? Gutteridge J.M.C.: Free radicals in biology and medicine. Oxford University Press, 1999. Gutteridge J.M.C., Halliwell B.: Antioxidants in nutrition, health, and disease. Oxford University Press, 1995. Doporučená literatura Free Radical Biology and Medicine Free Radical Research Redox Report Nitric Oxide Antioxidants and Redox Signalling Koloběh kyslíku Tvorba energie^ 3xl014 □ zásoby (mol) O toky (mol/rok) 3,8xl019O Atmosféra Děje počasí 1 x 1013 )ýchání/Rozkla( 1 x 1016 2,0xl017O2 v Živé organismy l,0xl02O2 Sedimentované horniny 6,0xl017O2 Fosilní paliva Fotosyntéza lxlO16 Historie kyslíku na Zemi 3,5 mid intenzivní sluneční záření > chemie volných radikálů > první složité organické molekuly > anaerobní život 2,5 mld modrozelené řasy: 2H20 —> 4H + O, 1,3 mld 500 mil 5 mil hladina 02 v atmosféře: 1% primitivní anaerobní organismy mizí, objevují se Eucaryota (rostliny, živočichové) hladina 02 v atmosféře: 10% > ozónová vrtsva > suchozemské formy života hladina 02 v atmosféře: 21%), objevil se člověk Adaptace organismů na kyslík r \/ r PRVNÍ zive organismy Anaerobní Adaptace Zánik Únik do anaerobního prostředí Adaptace organismů na kyslík • enzymy využívající kyslík a transportní řetězce elektronů • účinnější oxidace složek potravy, vytvářející více energie na jednotku hmoty potravy • antioxidační obranné mechanismy Dýchání a fotosyntéza glykolýza a respirace C6H1206 + 6 02 i — 6C02 + 6H20 fotosyntéza Dýchání a fotosyntéza [Ä]-P-P-P m itochünij r ÍQri Mitochondrie Vnější membrána Vnitřní membrána Krysta Matrix NADH NAD Dýchací řetězec 2e~ » NADH-koenzym Q reduktáza Ubiquinon (oxidovaný) le- Semiquinon (část. redukovaný) le- Ubiquinol (plně redukovaný) O N Ö o Cytochrom C *" KoQH2-cyt. C ^ reduktáza Antioxidační obranné mechanismy Antioxidant = jakákoliv látka, která oddaluje nebo inhibuje oxidatívni poškození cílové molekuly Látka, označovaná jako antioxidant by měla splňovat následující kritéria: - musí mít schopnost reagovat s biologicky odpovídajícími oxidanty a radikály - produkt odvozený z její reakce s radikálem musí být fyziologicky méně nebezpečný než odstraněný radikál - musí být přítomna v dostatečně vysoké koncentraci alespoň v určitých tkáních, aby mohla zajistit kvantitativně odpovídající úroveň reakce Antioxidační obranné mechanismy Primární antioxidanty: Prevence tvorby volných radikálů Sekundární antioxidanty: Vychytávání a odstranění vytvořených volných radikálů Terciární antioxidanty: Náprava oxidativního poškození makromolekul Primární antioxidanty Pevence tvorby volných radikálů: • Vyvázání iontů přechodných kovů • Regulace aktivity enzymů Sekundární antioxidanty Kompartmentalizace volných radikálů Vychytávače volných radikálů - Antioxidační enzymy (SOD, kataláza, glutathion peroxidáza a glutathion reduktáza) - Nízkomolekulární antioxidanty (glutathion, kys. močová, vitaminy, apod.) Terciární antioxidanty Oprava oxidačního poškození • DNA - glykosylázy specifické pro určité oxidované báze - nespecifické excision opravné enzymy • Proteiny - proteolytické enzymy • Lipidové hydroperoxidy - glutathion peroxidáza Co je volný radikál? nepárový elektron ve vnějších valenčních orbitalech lichý počet elektronů relativně vysoká reaktivita Jak značíme volný radikál? HO« ~ HO* Jak značíme volný radikál? volný radikál anion o molekula Reaktivní formy kyslíku a dusíku Volné radikály Látky neradikálové povahy Reaktivní formy kyslíku Superoxid o2-- Peroxid vodíku H202 Hydroxylový radikál HO Kyselina chlorná HOCI Alkoxylový radikál RO Ozon O3 Peroxylový radikál ROO Singletový kyslík •o2 Reaktivní formy dusíku Oxid dusnatý NO Peroxynitrit ONOO- Oxid dusičitý N02. Dusitany N02- Dusičnany NO3- Nitrosyl NO+ Reaktivní formy kyslíku Q' Q' Q' Q' 02 -----> 02 - -----> H202-----> OH -----> OH 2 H+ - OH Reaktivní formy kyslíku Molekulární kyslík - ■3S02 Singletový kyslík -1^02 a*2p ^^^^H a*2p ^^^^^M TT*2p + -f TT*2p E^^E9 TT2p vT vT ■ A tt2p R^K^a a2p ^E^^l a2p ■#■ a*2s ^En^l a*2s ^K^^l a2s ^En^l a2s ^E?^| [He] [He] Odhadované poločasy rozpadu volných radikálů v biologických systémech Reaktivní meta boli t kyslíku (dusíku) ti/2 [sec] Hydroxylový radikál HO» io-9 Alkoxylový radikál RO» io-6 Peroxylový radikál ROO» ío-1 Oxid dusnatý NO» 1- 10 Peroxynitrit ONOO- 0,05 - 1 Redukční potenciály některých RMK >o -O O o >o X O CD O O C/5 Oxidovaná/redukovaná forma Redukční potenciál (V) H20 / hydratovaný elektron -2,84 02, H+ / H02« -0,46 Fe3+ -transferrin / Fe 2+ -0,40 o2 / o2.- -0,33 NAD+, H+ / NADH -0,32 Fe3+ -ferritin / Fe 2+ -0,19 Ubiquinone / Ubisemiquinone -0,04 H202,H+, /H20,HO 0,32 02.-, 2H+ / H202 0,94 ROO, H+ / ROOH 0,77-1,44 RO«, H+ / ROH 1,60 HO», H+ / H20 2,31 Redukční potenciály některých RMD Oxidovaná/redukovaná forma Redukční potenciál (V) NO» / NO- 0,39 N02» / N02- 0,99 NO+ / NO» 1,21 N02+ / N02» 1,60 ONOOH / N02» 2,10 HO», H+ / H20 2,31 Vznik a zánik radikálů Oxidace Redukce Homolytické štěpení kovalentní vazby záření (např. UV) mikrovlnné záření ultrazvuk? Oxidace vs. redukce c + o2 ^> co2 02#- => 02 + e-C02 + C ^> 2CO C + 2H2 ^> CH4 02 + e - => 02*- Oxidační činidlo: oxiduje jinou látku (odebírají elektron, odebírá vodík, nebo poskytuje kyslík) Redukční činidlo: redukuje jinou látku (poskytuje jí elektron, vodík, nebo odebírá kyslík) Oxidace nabytí kyslíku ztráta elektronu Redukce ztráta kyslíku nabytí vodíku nabytí elektronu lonty přechodných kovů a volné radikály Haber - Weissova reakce: HoOo + Oo*- --------------►Oo + HO+HO* Přechodnými kovy katalyzovaná Haber - Weissova reakce: 02- + Fe3+-----------------► 02 + Fe2+ Fe2+ + H202 --------------► Fe3+ + HO" + HO* (Fentonova reakce) Fe2+ + ROOH -----------► Fe3+ + HO+RO* Dismutace ROS 202- + 2H H202 + Cl- H,0, + OCľ L2W2 02'- + 02'- + 2H 02- + NO*. ONOO" + HH ONOOH H202 + ONOO- - H202 + 02 ■ HX> + OCľ • H,0, + Cľ + 10- l2KJ2 ■ ^02 + ^2 - ONOO- • ONOOH ■ HO' + N02' ■ 102 + N02- + H20 • Iniciace • Propagace • Terminace Reaktivita ROS Rj + e- •R^Ra-•R2 + R3 - •R3 + R4-•R+R > R2 + R3 > R3 + R4 -^R-R Patofyziologie volných radikálu FYZIOL. FUNKCE ZDROJ POŠKOZENI oxidace Cyt. P-450 xenobiotik --------------► Avllv KJ 1.V/ tllv Mitochondrie energie regulace DNA proteiny o Endotel. buňky _r J lipidy hladkého svalstva i j i sacharidy destrukce Fagocyty níítncrprm Prooxidanty Oxidatívni stres Antioxidanty 1 1 /\