Fagocyty Fagocytóza, faktory fagocytů Komplementový systém Prostanoidy Reakce cévního endotelu Mechanismy obranného zánětu Srážení krve Specifická fáze zánětu nedegradované Ag štěpy jsou ve vazbě s MHC proteiny prezentovány lymfocytům Ilja Mečnikov Fagocyty larev mořské hvězdice obklopily třísku; Dhagocytóza & digesce Dakterií Mos & PMNS -► poprvé použit pojem fagocyt: Původ z řeckých slov phagein -jíst cytos - buňka Buněčná podstata imunity Nobelova cena 1908 Nei V > phagocytóza, intracelulární zabíjení, zánět, poškození tkání > charakteristické jádro > granula a CD66 membránový marker > krátce žijící, v nadbytku v krvi, chybí ve zdravé tkáni Polymorfonukleární leukocyty (PMNs) *40-65% všech leukocytu (3-5 x 103 /ul krve) *první obranná linie v boji proti patogenním mikroorganismům *chemotaxe *fagocytóza * generování RMK a RMD *degranulace Monocyty/Makrofágy > fagocytóza, zabíjení, obnova tkání, prezentace antigénu pro specifickou im. odpověď > charakteristické jádro a CD14 membránový marker, adherují na plast a sklo > aktivují se působením cytokinů, > samy cytokiny produkují > likvidují i maligní a pozměněné vlastní struktury Monocyty/makrofágy Neutrofily Morfologie Velké mononukleární buňky s granulami cytoplasmou Malé buňky s „ mul ti-1 obed" jádrem a neutrálními cytoplasmatickými granulemi Lokalizace Krev/tkáně Krev - odvod do místa infekce Po zabití bakterie Migrují do lokálních lymf. uzlin Umírají na místě apoptózou (zbytekje zlikvidován makrofágy) Prezentace antigénu Mohou prezentovat Ag (MHC 2. třídy upregul ováné IFNy) Nemohou prezentovat Ag (neexprimují MHC 2. třídy) Aktivace fagocytů v zánětu SOS signály -N-fMLP - Peptidy z kaskády srážení krve -PGs, LTs, PAF -Komplement -Prozánětlivé cytokiny Odpověď fagocytů -chemotaxe - adherence -diapedéza -aktivace -fagocytóza a zabití Jak neutrofily dosáhnou místa infekce ? 1. Rolling 2. Activation 3. Arrest/ adhesion 4. Migration seleetin II r Iiitegiiu ICAM Inflaniniatory cytokines Activation (chemo attr acta n ts) Che íuoa ttr ac tan ts INFLAMMATION SITE PHAGOCYTOSIS DEGRANULATION OXIDATIVE ACTIVITY TISSUE DAMAGE Tissue Opsonizace Extracelulární bakterie Opsonizace (Ab, C) Ingesce fagocytem (Fe receptory, CR) Digesce v lysozómu ničiace fagocytózy Adheze cestou U ScavengerR U IgG FcR W CR Mj Toll-like R Zabíječské mechanismy fagocytů Class of mechanism Specific products Acidification pH=~3.5-4.0, bacteriostatic or bactericidal Toxic oxygen-derived products Superoxide 02~ hydrogen peroxide H202, singlet oxygen 102, hydroxylradical OH" hypohaliteOCI" Toxic nitrogen oxides Nitric oxide NO Antimicrobial peptides Defensins and cationic proteins Enzymes Lysozyme-dissolvescell walls of some Gram-positive bacteria. Acid hydrolases—further digest bacteria Competitors Lactoferrin (binds Fe) and vitamin Bi2-binding protein Figure 2-6 Immunobiology, 6/e. (© Garland Science 2005) Charakteristika granulí neutrofilů primární granula azurofilní; characteristické pro mladé neutrofily Obsahují: neutrální proteasy - cathepsin G, elastasa, proteinasa 3 lysozym, defensiny, proteasy, fosfolipasu A2 a myeloperoxidasu sekundární granula specifické pro zralé neutrofily obsahují lysozym, NADPH oxidasa, laktoferrin, elastasa, kolagenasa Terciární granula - na předním konci migrujících fagocytu -gelatinasa (destrukce membrán) Lysozomy -obsahují kyselé hydrolasy Sekreční váčky - reservoir membránových komponent Microbe or other partlcie Plasma membrane i\ Pseudopod / ť* V- Phagosome I ) (phagocytic Cytopla- \^y vesicle) Lysosome V Digestive enzymes Phagocytt Partially digested microbe Phagolysosomes Residual body Incifjesiibl material (a) Phases ol phagocytosis Copyright © 2001 Benjamin Cummings, an imprint of Addison Wesley Longman, Inc A Chemotaxis and adherence of microbe to phagocyte. Q Ingestion ol microbe by phagocyte. Q FormatOn of a phagosome. Q Fusion of the phagosome with a lysosome to form a phagolysosome. Q Digestion of ingested microbe by enzymes. Q Formation of residual body containing indigestible material Q Discharge of waste materials. Annu. Rev. Immunol. 2005. 23:197-223 doi: 10.1 l46/annurev.immunol.23.021704.115653 Copyright (c) 2005 by Annual Reviews. All rights reserved How Neutrophils Kill Microbes Anthony W. Segal Center for Molecular Medicine, University College Lot/don, London WCIE6JJ, United Kingdom: email: t.segal@ucl.ac.nk ľi^uiv I Transmission electron micrograph of a human neutrophil. Insel is an image laken ľrom;iiKUlrophíl2usaíki the phagocytosis^^^ The seclíon was stained for ni)^loperoxídase<\1ft)) to reveal the eleclronuense pnxlud in Ihea/uiophíl granules, sonic of which can he seen de<:ranulalín£ inlolhe phagocytic vacuole íairows). Haf = I fim. dilute Írom 17.i NA DP H OXIDASE ACTIVATION CELL MEMBRANE HOCI OOOOpOQ Gap] W__ phox phox t icccco Cell activation OGOOQQ3 (rapt NADPH 2H+ Proton \ channel \ NADP* + 2H+ CYTOSOL Schematic representation of the NADPH oxidase enzyme. The integral membrane of the phagocyte consists of two subunits: p22phox and gp91phox which respectively produce the smaller and larger chain of the cytochrome-b558. Two cytosolic subunits: p67phox and p47phox; a p40phox accessory protein and a Rac-GTP binding protein then translocate to the cell membrane upon cell activation to form the NADPH oxidase complex which generates a respiratory burst. Superoxide can react to form hydrogen peroxide and hypochlorus acid, which together participate in bacterial killing. Assari Medical Immunology 2006 5:4 doi: 10.1186/1476-9433-5-4 o O: p22p*x 11111111111 wwvwwwt p47phox p4 NADP NADPH The classical NADPH oxidase comprises a membrane-bound gp91^ox/p22^ox heterodimer and other subunits (p6JPhox, p4JPhox, p40^ox and Rac) which associate with this complex in the activated enzyme. The NADPH-binding domain is predicted to be on one side of the membrane, whereas 02 ■ generation is predicted to occur on the other. The oxidase may be located on the plasma membrane or on intracellular membranes depending upon the cell type. STIMULÁCIA GSH - PEROXIDAZA KATALAZA PEROXIDACIA CtO-HALOGENIZÁCIA PEROXIDACIA LIPIDOV DEŠTRUKCIA MEMBRÁN FRAGMENTÁCIA PROTEÍNOV POŠKOOENIE DNA SVETLO Obr. 155. Schéma respiračného vzplanutia fagocytov a tvorby toxických foriem kyslíka HMPS — hexózomonofosfálový skrat. G6PD glukó/a-6-fosfátdehydrogenáza. GSSG a GSH — redukovaná a oxidovaná forma glutationu, NADPH a NADP* -- redukovaná a oxidovaná forma nikolinamidadenindinukleotid-fosfátu, SOD — superoxiddismutaza. MPO myeloperoxidáza. 0\ superoxidový aniónový radikál. OH — hydroxylový radikál. O, singletový kyslík Oxidative activity Dismutation H202 Nat. enz. X" + H20 cr, Br, r, -scn ------► Comp. I Myeloperoxidase \ / Comp. II Reaktivní formy kyslíku a dusíku Volné radikály Látky neradikálové povahy Reaktivní formy kyslíku Superoxid o2.- Peroxid vodíku H202 Hydroxylový radikál HO« Kyselina chlorná HOCI Alkoxylový radikál RO« Ozon O3 Peroxylový radikál ROO« Singletový kyslík lo2 Reaktivní formy dusíku Oxid dusnatý NO- Peroxynitrit ONOO- Oxid dusičitý NO^ Dusitany N02" Dusičnany NO3- Nitrosyl NO+ Regulation of iNOS Expression £> Ligand -*^»t^ IKK Proteasome J degradation C D iNOS protein NF-kB €• nucleus kB site iNOS gene iNOS RNA Správná funkce fagocytu je pro organismus nezbytná Deficience ve funkcích fagocytu = těžký průběh banálních infekcí. Příklad: CGD - defektní NADPH oxidáza Naopak hyperaktivace fagocytu - problémy: poškození okolních buněk a tkání reaktivními metabolity a proteolytickými enzymy Metodv stanovení reaktivních metabolitů kvslíku Kolorimetrické metody Stanovení spotřeby kyslíku Elektronová para mag n etická rezonance Luminometrické metody Fluorescenční metody Kolorimetrické metod NBT test - princip metody spočívá v redukci žluté tetrazoliové soli (NBT) superoxidem na modrý produkt formazan. Redukce cytochromu c - superoxidový anion redukuje bezbarvý oxidovaný (ferri-) cytochrom c na barevnou formu. Stanovení spotřeby kyslíku Metoda založená na detekci změny koncentrace kyslíku v médiu pomoci Čiarkový elektrody. Je používána především k detekci intenzity respiračního vzplanutí. Elektronová Daramaanetická rezonance Radikál reaguje s příslušnou próbou (tzv. spin-trapping). Následně jsou pomocí speciálního přístroje analyzována paramagnetická spektra. Luminometrické metod Luminometrické próby (luminofory) jsou oxidovány RMK Při návratu do základního energetického stavu emitují fotony. Jejich detekce je možná pomocí luminometrů nebo scintilačních spektrofotometrů. Neičastěii používané luminofoi - Luminol - Lucigenin - Izoluminol - Pholasin (a) N-H N-H O luminol Izoluminol CH3 lucigenin PHOLASIN Photoprotein of the bioluminescent mollusc Emits light in the presence of free radicals, oxidants and oxidases Pholasin is isolated and purified by: Knight Scientific Limited (UK) 100 n Luminol + S. mutans 80 control 360 _i 40 O 20 n J / SOD/CAT U 1 C ) 10 i 20 lili 30 40 50 60 time (min) 250 n Luminol + opsonized S. mutans 200 control 3150 CĽ _i100 o SOD/CAT^V 50 n U 1 C ) 10 iii 20 30 40 50 60 time (min) o Isoluminol + S. mutans 10 20 30 40 time (min) 50 60 0 Isoluminol + opsonized S. mutans^ control 10 20 30 40 time (min) 50 60 Fluorescenční metod Princip Reakcí s RMK se původně nefluorescenční látky (tzv. fluorescenční próby) mění na látky fluorescenční. Tuto fluorescenci je možné detekovat pomocí: - fluorimetru - fluorescenčního mikroskopu - konfokálního mikroskopu - flow cvtometru Výhody detekce pomocí flow cytometru - analýza velkého počtu buněk v krátkém čase (1000 buněk/sec) - možnost současného hodnocení více buněčných populací v jednom vzorku - hodnocení funkčních vlastností živých i fixovaných buněk lá^lMK^ll dichlorofluorescin diacetate, dihydrorhodamin 123 nebo hydroethidin Fluorescent Indicators How the assays work: • Superoxide: Utilizes hydroethidine the sodium borohydride reduced derivative of EB • Hydrogen Peroxide: DCFH-DA is freely permeable and enters the cell where cellular esterases hydrolyze the acetate moieties making a polar structure which remain in the cell. Oxidants (H202) oxidize the DCFH to fluorescent DCF • Nitric Oxide: DCFH-DA can also be used as an indicator for nitric oxide in a manner similar to H^O DCFH-DA *DCFH * DCF 2',7'-dichlorofluorescin diacetate O O CH3-C-Q ^^ „O., ^s. . n_C-CH3