Oxid dusnatý Antonín Lojek Kromě mnoha literárních pramenů byla k přípravě použita také přednáška Dr. Hampla - FN Motol. (http://physiology.lß.cuni.cz/hampl/teach_slides/no_slides/index.htm) Oxid dusnatý ( = nitric oxide = NO) NO je molekulou složenou z 1 atomu kyslíku a 1 atomu dusíku Tyto atomy jsou vázány dvojnou vazbou Na atomu kyslíku se nacházejí 2 páry elektronů (nevazebných) Na atomu dusíku se nachází 1 pár nevazebných elektronů a jeden elektron n e párový Molecular formula NO Structural formula N = 0 Molecular models Space filling Ball-and-stick NITRIC OXIDE Nitric oxide (NO), a colorless gas that turns brown when it contacts air, is a known pollutant and component of cigarette smoke and automobile exhaust. But in the body, NO is a chemical messenger with a role in the relaxation of smooth muscle cells. Atmospheric Nitrogen Oxides Los Angeles l Oxid dusnatý • ještě před pár lety pouze nepříjemné a nebezpečné znečištění ovzduší přispívající ke smogu a kyselým dešťům, dnes nejstudovanější endogenní molekula posledních 20 let • explozivní rozvoj znalostí (cca 300 nových publikací měsíčně) • nové téma, ve starších učebnicích chybí • "Molekula roku" 1992 prestižního vědeckého časopisu Science • účastní se funkce všech hlavních orgánových systémů • během několika let postup od základního objevu k významným klinickým pokrokům (PPHN, ARDS, šok, impotence) Persistent Pulmonary Hvvertension of the Newborn http://www.persistent-pulmonary-hypertension-newborn.com/ Persistent pulmonary hypertension of the newborn (PPHN) occurs when a newborn's circulation system does not adapt to breathing outside the womb. While a fetus is in the womb, it gets its oxygen from its mother's placenta through the umbilical cords, so the lungs need little blood supply. In PPHN the newborn's arteries to the lungs remain constricted after delivery, limiting the amount of blood flow to the lungs and therefore the amount of oxygen into the bloodstream. Acute respiratory distress syndrome http://en.wikipedia.org/wiki/Acute_respiratory_distress_syndrome Acute respiratory distress syndrome (ARDS), also known as respiratory distress syndrome (RDS) or adult respiratory distress Syndrome (in contrast with IRDS) is a serious reaction to various forms of injuries to the lung. ARDS is a severe lung disease caused by a variety of direct and indirect issues. It is characterized by inflammation of the lung parenchyma leading to impaired gas exchange with concomitant systemic release of inflammatory mediators causing inflammation, hypoxemia and frequently resulting in multiple organ failure. This condition is often lethal, usually requiring mechanical ventilation and admission to an intensive care unit. HISTORIE 1620 - NO prvně připraven Belgičanem Janem Baptistou van Helmontem (t.j. dříve než třeba kyslík - 1774) 1772 - chemicky charakterizován Josephem Priestley em (objevitel kyslíku) 1800 - toxicita (Sir Humphry Davy se málem zahubil, když to zkoušel dýchat) 1867 - amylnitrit snižuje krevní tlak při hypertenzi (dnes víme, Že to dělá tím, že uvolňuje NO) 1914-1918- dělníci plnící za první světové války nitroglycerin do dělostřeleckých granátů měli velmi nízký krevní tlak, což vedlo k zavedení nitroglycerinových tablet pro úlevu při angine pectoris; dnes víme, Že účinek amylnitritu i nitroglycerínu je zprostředkován oxidem dusnatým uvolňovaným z těchto látek 1977 - NO aktivuje guanylát cyklázu a tak zvyšuje intracelulární koncentraci cGMP (Ferid Murad) 1980 - objev endoteliálního relaxačního faktoru (EDRF, Robert Furchgott). Snaha identifikovat EDRF vedla bezprostředně k objevu, že EDRF = NO 1987 - schopnost eukaryotických buněk tvořit NO: Louis Ignarro, Salvador Moncada 1998 - Nobelova cena za fyziologii a lékařství: Robert F. Furchgott, Louis J. Ignarro, Ferid Murad (Mza klíčové objevy týkající se NO jako signální molekuly v kardiovaskulárním systému") (Moncada cenu nedostal, přestože to mnozí čekali) (Alfred Nobel vydělal na Nobelovy ceny tím, že vynalezl dynamit, založený na nitroglycerínu, sám trpěl ICHS, předepsali mu nitroglycerin, Nobel to považoval za ironické) 1916 Dept. of Pharmacology, SUNY Health Science Center New York Louis J Ignarro, Ferid Murad 1941 1936 Dept. of Molecular and Medical Dept. of Integrative Biology Pharmacology Pharmacology and Physiology UCLA School of Medicine University of Texas Medical Los Angeles School, Houston Furchgottův sandwich Furchgott prokázal, že relaxace cév indukovaná acetylcholinem je závislá na endoteliu. Použil dva kousky aorty, u jednoho odstranil epitelium Acetylcholine (http://en,wikipedia,org/wiki/Acetylcholine) Acetylcholine has functions both in the peripheral nervous system (PNS) and in the central nervous system (CNS) as a neuromodulator. In the PNS, acetylcholine activates muscles, and is a major neurotransmitter in the autonomic nervous system. In the CNS, acetylcholine and the associated neurons form a neurotransmitter system, the cholinergic system, which tends to cause excitatory actions. In PNS In the peripheral nervous system, acetylcholine activates muscles, and is a major neurotransmitter in the autonomic nervous system. . When acetylcholine binds to acetylcholine receptors on skeletal muscle fibers, it opens ligand gated sodium channels in the cell membrane. Sodium ions then enter the muscle cell, stimulating muscle contraction. Acetylcholine, while inducing contraction of skeletal muscles, instead induces decreased contraction in cardiac muscle fibers. This distinction is attributed to differences in receptor structure between skeletal and cardiac fibers. Ignarrova spektrální analýza Ignarro pomocí spektrální analýzy prokázal, že EDRF je totožný s NO £- ,..:> Hemoglobin (žlutý) exponovaný endoteliálním buňkám produkujícím EDRF (konverze oxyhemoglobinu na methemoglobin) Hemoglobin (žlutý) exponovaný přímo NO Posun v absorbční křivce je identický (EDRF = NO) Muradova enzymatická aktivace Murad věděl, že nitroglycerin působí relaxaci hladké svaloviny. Enzym guanylát cyklasa byla aktivována a indukovala zvýšení cGMP s následnou relaxací svalu. Působí nitroglycerin cestou uvolňování NO ??? Probublával NO přes tkáň obsahující enzym - cGMP se zvyšoval. Phosphate cGMP Myosin (relaxation) Guanylyl cyclase (GC) activated G C NO avidly binds to the heme moiety of hemoglobin (in red blood cells) and the heme moiety of the enzyme guanylyl cyclase This enzyme catalyzes the dephosphorylation of GTP to cGMP, which serves as a second messenger for many important cellular functions, particularly for signalling smooth muscle relaxation. Cyclic GMP induces smooth muscle relaxation by multiple mechanisms including increased intracellular cGMP, which inhibits calcium entry into the cell, and decreases intracellular calcium concentrations (click here for details) activates K+ channels, which leads to hyperpolarization and relaxation stimulates a cGMP-dependent protein kinase that activates myosin light chain phosphatase, the enzyme that dephosphorylates myosin light chains, which leads to smooth muscle relaxation. Něco málo chemie o NO NO je radikál (lichý počet valenčních elektronů, konkrétně 11 - o 1 víc než N2, o 1 míň než 02) to, že je to radikál, se někdy zdůrazňuje tečkou (NO), to ale není nutné, "radikálovost" je implicitní v označení NO z N2 a 02 se tvoří jen za specifických podmínek při vysokých teplotách, např. při blesku; taky vzniká ve spalovacích motorech a tepelných elektrárnách samovolně se nerozkládá, jen za vyššího tlaku - při něm pozvolna vzniká 2-3 % toxického N02 za měsíc (pozor na skladování v bombách!) poměrně málo rozpustný ve vodě (-1.7 mmol/1 při 25°C), t.j. řádově podobně jako 02 či N2 v přítomnosti kyslíku podléhá autooxidaci za vzniku N02: 2 NO + 02 --> 2 N02 autooxidace je asi 200x rychlejší v roztoku než v plynné fázi autooxidace je rychlá (několik sec), je-li NO i 02 hodně, ale celkem pomalá, je-li NO málo - jako je tomu většinou v tkáních, kde je NO méně než 10 uM (poločas NO tam může být až 500 sec) ve vodném roztoku jsou produktem autooxidace nitrity (N02~), pouze v přítomnosti hemoproteinů proběhne oxidace až na nitráty (NO3-) v přítomnosti superoxidu vzniká extrémně rychle peroxynitrit: NO + 02- --> OONO "OONO není radikál, aleje velmi reaktivní a cytotoxický NO je velmi rychle inaktivován oxidací s železem oxyhemoglobinu za vzniku N03" V savčích buňkách je NO tvořen oxidací terminálního guanidino dusíku L-argininu molekulárním kyslíkem; kromě NO vzniká L- citrulin L-arg + 02 --> NO + L-cit M Y MADPH NADPH H3N'"cOO L-Arflinírw -Nooe y ^XJOO NG-Hydroav-L-Arciinine L-Citrulline N=0 Nitric Celou komplexní reakci katalyzuje jediný enzym, NO syntáza, která existuje ve 3 isoformách Nitric oxide L-Arginine + 02 + NADPH Nitric Oxide I Jhiol FAD jmnthdB Synthase ý Citrulüne + NO + NADP I Guanylate cyclase GTP cGMP Syntásy oxidu dusnatého • neuronální syntása oxidu dusnatého (NOS1 = nNOS) • inducibilní syntása oxidu dusnatého (NOS2 = iNOS) • endotheliální syntása oxidu dusnatého (NOS3 = eNOS) Každá z těchto syntás: • má rozdílnou tkáňovou distribuci • lokalizovaná na různých chromozomech Všechny 3 isoformy NO syntázy: Arginine jsou aktivní jako homodimery obsahují v aktivním centru hem jsou stereospecifické (D-arginin není substrátem) ^/ Cltrulllne NADP* NADPH / CHralline jako kofaktory vyžadují: NADPH, 6(R)-5,6,7,8-tetrahydrobiopterin, FAD, FMN a kalmodulin (ten se k NOS typu I a III váže po navázání Ca na kalmodulin, NOS II váže kalmodulin trvale) UCINKY NO NA CÍLOVOU TKÁN při velkých množstvích obvykle převládá oxidace (02, 02_) za tvorby vysoce reaktivních, cytotoxických produktů (ONOO) - zabíjení i jinak obtížně zlikvidovatelných baktérií (např. Mycobacterium tuberculosis), hub, parasitů a tumorů, inhibice replikace virů v nižších koncentracích je oxidace pomalá, většinou převládá regulační působení prostřednictvím aktivace solubilní isoformy enzymu guanylat cyklázy (heterodimer obsahující hem, s kterým právě NO interaguje) aktivace guanylat cyklázy zvyšuje v cílové buňce koncentraci cyklického guanosin-3',5'-monofosfátu (cGMP), ten zprostředkuje účinky NO cGMP: - snižuje intracelulární koncentraci Ca2+, v hladkém svalu přímo inhibuje kontraktilní aparát - cGMP je inaktivován cGMP- fosfodiesterázami na 5?-GMP (selektivním inhibitorem PDE V je třeba zaprinast - slibné pokusy s klinickým využitím; taky Viagra) FYZIOLOGIE NO Neurotransmitter - učení, paměť, spánek, bolest, deprese Zabíjí viry, baktérie, parazity, tumory (iNOS; indukci inhibují kortokosteroidy) Inhibuje mitochondriální respiraci Vazodilatace závislá na endotelu (ACh, eNOS) Nejvíc NO se dělá v nose a paranasálních dutinách - Pravděpodobně důležité pro jejich dezinfekci - NO lze dobře měřit ve vydechovaném vzduchu - Malá část vydechovaného NO pochází z dolních dýchacích cest (lze měřit odebíráním vzorků z úst) - mění se při některých nemocech, např. astma) Příklad: koncentrace NO ve vydechovaném vzduchu zdravých lidí. Hodnoty jsou nejvyšší při odebírání vzorků z nosu a podstatně nižší v ústech a distálnějších úsecích dýchacích cest. V periferní průdušce je koncentrace NO pod detekčním limitem vysoce citlivé chemiluminiscenční metody (Chest 110: 930-938; 1996). NO Detection by Gas Phase Chemiluminescence Detection Principle: NO is purged from an aqueous solution using an innert gas such as Ar or He and transferred to a mixing chamber where it reacts with 03 under reduced pressure. NO + O3 —► N02* + 02 * —► NOo + h ■ u The light emitted by excited N02 upon returning to the ground state is measured by photon counting (fmol-pmol). Not very useful when attempting to quantify NO in physiological fluids such as serum, plasma or urine. Why? Chemiluminiscenční přímá metoda ■ ■*— Ozone C hem i l u mi nescence reaction Reaction^ chamber Sample capillary Vacuum Photon counter NO + O. -► N02 + 02 + light NO sensitizuje presynaptický neuron k silnějšímu signálu. To následně vede k silnější odpovědi postsynaptického neuronu. Fyziologický význam NO Komunikace mezi nervovými buňkami v mozku O může zlepšovat čich Relaxace cév při ateroskleróze (nitroglycerín) Důležitý zánětlivý mediator jyý •- Lj^fcv_, v ■'■JjT**- ■rVA'|J 'j *£M SSE*,