Řezové preparáty Barvení histologické a histochemícke Rezy ruční - žiletka, břitva, ruční mikrotom Rezy připravené mikrotomem Schema príprav mikroskopických preparátu % T fixace macerace rucni projasňování roztlak řezy barvení T T montáž do proj. média kryo řezy fixace kryoprotekce zmrazení řezání: zmrazovací mikrotom, kryostat T barvení • parafínové řezy fixace dehydratace převádění do parafínu řezání: mikrotom •rotační^ •sáňkový žehlení a lepení odparafínování barvení polotenké řezy fixace dehydratace prosycení monomerem polymerizace řezání: mikrotom rotační ultramikrotom barvení montáž do média mísitelného s vodou dehydratace dehydratace 1 1 montáž do vody montáž do barviva montáž do média nemísitelného s vodou Ruční mikrotom Fixace • zachování buněk a pletiv ve stavu co nejbližšímu k živému stavu • sn\žeri\ strukturálních změn a změn chemického složení • strukturální proteiny a jiné sloučeniny se musí změnit na nerozpustné ve všech reagenciích, se kterými přijdou v průběhu celého procesu do styku • perfektní fixace = jen teoretická Fixace • fyzikální - vysoká teplota - koagulace bílkovin, tání tuku - chladová - „freeze drying' - „freeze substitution" • chemická - f ixativa koagulující - koagulace cytoplazmatíckých proteinu ničí strukturu organel (např. mitochondrie) - f ixativa nekoagulující - zachovávají organely (pro EM) Fixační směsi - ?AA (FPA) Formaldehyde-Acetic (Propionic) acid - Aethanol • 50% nebo 70% ethanol 90 ml • ledová kyselina octová 5 ml • 37 - 40% formaldehyd 5 ml fixáž koagulující stálá rychle proniká pro anatomické účely Obecný postup parafínové metody Odběr materiálu - segmenty Fixace segmentu Dehydratace (etanolova řada vzestupná) Prosycení rozpouštědlem parafínu (xylén) Prosycení parafínem Zalití do parafínu Krájení, žehlení a lepení parafínových řezu Rozpuštění parafínu na řezech (xylén) Rehydratace řezu (etanolová řada sestupná) Barvení řezu Dehydratace nabarvených řezu Montáž (uzavírání řezu) do média nemísitelného s vodou (kanadský balzám, Eukitt®, Entelan, ĎPX) dehydratace Braune et al. 1982 ä 98-100% 2h 60% 90% 96% Äthanol 70% 4hocjjänger 4h od länger 4h od. länger Vorratsgefaß , , , Zalévaní do parafinu ,r převádění do parafínu [\£<^ ^C^ , _^ ,___ __. Cjögfc -Hbr fefc.TS^=i. ä í noc™„ Paraffin ftrrt». ^f-r^F. *»-» ££k £*& Ä> beliebia lanae 1h 60° 1-2h60° fin 1-2h ' Benzol/Paraf- zalévaní do parafinu chlazení Paraffin einfüllen t /? »|,?^......'i ■ • ■ * * Objekte einlegen 1 Einbettschale innen mit Glyzerin einreiben ^Ci^...®^M Ý ľo///í?es Erstarren ^ parafínový ] bloček [lasche filtrieren 60° C oô/ert/e ausrichten Beginn des Erstarrens Herauslösen des Blockes Příprava bio dělení bloku parafínu izolovaný bloček parafínu čku ke krájení cm V přitavení bločku parafínu na dřevěný špalík trimování bločku parafínu Krájení parafínových řezu rozdělení na bločky lepení bločku na špalík í Zuschneiden Anschweißen Ankleben Paraffin auf Zuschneiden Holzblock Brechen krájení řezu Messerstellung richlig __ 힧\ krumme Bänder: Messerschneide Anreißen lepení řezu . ,.. Film aus Eiweißglyzerin I zu flach ,.ö| f — rw^ 5« z/y ^ ÜberscNWenjLWass^ I Tro/7/ cfes 5/ocfes ^^ >/ Paro////7 zu /?ar/ ..,.F^<^__v ^ unparallel ítív ^^ Raumlemperq- € lur zu niedrig Bänder auflegen zu steil hier Band trennen Schnitte zu dünn Strecken Paraffin zu weich Raumtempera -für zu hoch Wasser absaugen in den Trockenschrank 4 (~50°C) Braune et al. 1982 Bänder richten Mikrotomy sáňkový mikrotom Reichert rotační mikrotom Leitz Skleněné a porcelánové kyvety s víčkem >^ .-f ^ ^^^i -. ....■i jf * M r UT-^f ta T^^KL-f. r V ť ^^EU^ N^ Ir^- p * ^M^tl \ Hellendahl Coplin na 6 skel Schiefferdecker Dóza s držákem skel Sada plastových kyvet na barvení skla v držáku se přenášejí z jedné lázně do druhé najednou Barva barva - vjem světla podle jeho kvality (A) purpurová 700 nm červená 650 nm oranžová 600 nm žlutá 550 nm zelená 500 nm modrá 450 nm fialová 400 nm průchodem světla přes barevné preparáty dochází k absorpci světla komplementární barvy Barvivo • ne všechny barevné sloučeniny mohou být barvivem • barvivo = barevná sloučenina, která může být navázána na substrát • barvivo histologické - barví různé složky pletiv, používá se na základě empirických znalostí, chemismus reakce často r\er\\ známý • histochemicke barvení - barvící proces je vysoce specifický, je známá jeho chemická podstata Teorie barevnosti • chromoforova: chromofor - má charakteristické uspořádání atomů, které je zodpovědné za za absopci světla v určité části spektra, auxochrom - část molekuly, která zodpovídá za vazbu na substrát • kyselé radikály: -OH, -COOH, -S03H anionická barviva • bazické radikály: -NH2 kationická barviva • chinoidní struktury V 7i -el. páru Dělení barviv podle původu • přírodní karmín - červec nopálový orcein -lišejníky {Lecanora, Roccella) hematoxylin - dřevo kampešky (Haematoxylon campechianum) brasilin - dřevo druhu rodu Caesalpinia (Caesalpinia sappan, C. brasiliensis) indigo - Indigo f era tinctoria, Isatis tinctoria juglon - listy, kořeny, kura Juglandaceae • syntetická Hematoxylin hematoxylin = sloučenina tmavě modrofialové barvy ze dřeva Haematoxylon campechianum Používá se s mořidly - nejčastěj i Fe3+ nebo Al3+ Natural Black 1 nebo C.I. 75290 a hematein barví teprve jeho oxidovaná forma = hematein lze barvit regresivní i progresivní metodou - záleží na formě aplikace mořidla Podélný parafínový řez semenem sněženky Galant hus nivalis L. regresivní barvení Heidenheinovým železitým hematoxylinem optimální diferenciace = v jódech buněk embrya i endospermu jsou patrná +IV1S1W19 í■ Tk/inu0M/i \r*f\/»rs\fr* P» ístlss\ *r\r\rs\A\r\ Parafínový řez poupětem máku, Papaver somniferum ► i* Delafielduv hematoxilin, progresivní barvení, Al3+jako mořidlo kanadský balzám Indigo Indigofera tinctoria Isatis tinctoria dnes již vyráběné synteticky pro vlastní barvení řezů se nepoužívá, ale v histochemii jsou často používány tzv. indigogenní metody ni>|aľqo ipAuazojoiz nzaj nADjdud oud woiojmioi O ' I'll/ Q A /A ' I» +d+soXj>| Kryostatovy řez listem tabáku tloušťka řezu 30|im Indigogenní metoda detekce aktivity ß-glukosidasy se substituovaným indoxyl glukosidem jako substrátem bělení barviv podle chromoforu nitrobarviva (trinitrofenol) -N02 azobarvíva (oranž G, Bísmarkova hněď, Sudan IV, Fast Blue B...) -N=N- fenylmetanová barviva = arylmetanova (p-rosanilin, fuchsin, Magenta, gene i áno vá violeť, Fast green) chinolinová barviva (indofenol, aziny) xanthenová barviva (fluorescein, eosin, Giemza = azureosinát, rhodamin) ftalocyaninová (alcianová modř) Druhy a způsoby barvení podle výsledku a aplikace • Barvení progresivní: barvíme do žádané intenzity zbarvení (Mayeruv nebo Delafíelduv hematoxylin) • Barvení regresivní: preparát prebarvujeme a pak postupně odbarvujeme (diferencujeme), podle afinity struktur k barvivu se některé odbarví zcela, jiné zůstanou zbarvené (Heidenheinuv železitý hematoxylin, safranin) Druhy a způsoby barvení podle výsledku a aplikace • barvení simultánní: směs barviv v jednom roztoku (složky nesmějí spolu reagovat) (Alexander) • barvení sukcedánní (sukcesivni): dvě barviva po sobě, doplňují se barevné tóny, každé barvivo barví jiné struktury (alcianová modř - pravá jaderná červeň, safranin - Fast Green, bazický fuchsin - pikroindigo karmín /Cajal - Brožkova metoda/) Druhy a způsoby barvení podle výsledku a aplikace • barvení substantívni: barvení samotným barvivem ve vodném nebo etanolovém roztoku • barvení adjektivní: použití mořidel (soli kovu = kamence, tanin), barvení adjektivní přímé = směs barviva a moridla (Ehrlichuv, Mayeruv, Delafíelduv hematoxylin), barvení adjektivní nepřímé = nejprve řezy moříme a pak barvíme (Heídeheínuv železitý hematoxylin) Postup při podvojném sukcesivním barvení: alcianová modř - jaderná červeň stálá (Kernechtrot, nuclear fast red) 1. odparafínování řezu (xylen) 2. převedení řezu do vody 3. vlastní barvení: a) 3% roztok kyseliny octové 10 min. b) barvení buněčných stěn - 1% alcianová modř v 1% kyselině octové 10 min. c) opláchnutí 3% kyselinou octovou d) praní v tekoucí vodě 10 min. e) barvení buněčných jader - 0,1% jaderná červeň stálá v 5% roztoku AI2(S04)3, 5-15 min. 4. opláchnutí destilovanou vodou 5. odvodnění alkoholovou řadou 6. převod do xylenu 7. uzavření do Eukittu Podvojné barvení sukcedánní: alcíanova modř - pravá jaderná červeň parafínový řez listem kosatce Irissp. tloušťka řezu 15|am Podvojné barvení sukcedánní: alcianová modř - pravá jaderná červeň v^v * v pncny rez stonkem nocenky Mírabílís jalapa 12 |Lim Klíční rostlina Arabidopsis podvojné barvení Saf ranin - Fast green ĎIC N^ regresivní barvení safraninem správna ferenciace SK. 2 <** podélné parafínové řezy tloušťka řezu 8 jam slabá diferenciace \ 7 dní Olympus BX-61 Odkazy na zajímavé stránky Univerzita v Bristolu - metody histologického barvení http: //www. bristol. ac. uk/vetpath/cpl/histmeth. htm stránky kurzu Botanická mikrotechnika UK Praha (A.Soukup, O.Votrubova) http://kfrserver.natur.cuni.cz/studium/prednasky/mikro/prep/tprep.htm metody histologie a imunohistochemie http://www.ihcworld.com/antibody_staining.htm protokoly barvení pro pletiva zalitá v pryskyřici Energy Beam Sciences http: //www. ebsciences. com/staining/orcein. htm encyklopedie http://cs.wikipedia.org/wiki/Barven%C3%AD_(biologie) http://encyklopedie, seznam. cz/search/?s=barven%C3%AD&source=3 fixace a protokoly základních barvení http: //www. nottingham. ac. uk/pathology/default. html http://stainsfile.info/StainsFile/jindex.html