preparace slinných žláz larev pakomára meióza spermatogeneze oogeneze PREPARACE BUNĚK SLINNÝCH ŽLAZ – LARVA PAKOMÁRA ü Larva pakomára: - Fixace: Du Noyerova fixáž (96% alkohol a kyselina octová ledová, 3:1) - Barvení: ORCEIN – larvy v orceinu cca 20-40 min, potom do PBS ü Na očistěné podložní sklíčko pinzetou přeneseme larvu, přikápneme PBS. Larva nesmí vyschnout! ü Pracujeme pod preparačním mikroskopem. ü Odstraníme larvě hlavu. ü Vytlačíme obsah 2-3 tělních článků. ü Slinné žlázy – viz obrázek. ü Odstraníme zbytek těla z podložního skla. ü Slinné žlázy přiklopíme krycím sklíčkem a pozorujeme polyedrické buňky s polytenními chromozómy v jádře. ü Zakreslíme. Běžný světelný mikroskop: Pozorování objektů v procházejícím světle, světlo vstupuje rovnoběžně s optickou osou mikroskopu, kolmo na preparát. - malá pracovní vzdálenost - převrácený obraz - objekty musí být tenké - obraz plochý Preparační mikroskop: Pozorování objektů v dopadajícím světle, pozorování i velkých objektů, značná hloubka ostrosti – plastický a nepřevrácený obraz povrchu preparátu. - 2 složené mikroskopy (2 okuláry a 2 objektivy), optické osy svírají ostrý úhel, 2 obrazy různých stran objektu – oko vnímá 1 stereoobraz - Pod okuláry skleněné hranoly (Porrova prismata) – obracejí převrácený obraz vytvořený objektivy – v oku obraz obraz nepřevrácený - Světelný zdroj – světlo dopadá pod různými úhly shora (lze osvětlit i zdola). Objekt pozorován v odraženém světle – zobrazení povrchu (reliéf) - Objektivy s malým zvětšením – velká pracovní vzdálenost - Světlý nebo tmavý kotouč – světlé nebo tmavé pole MEIÓZA • 2 buněčná dělení a pouze 1 replikace DNA • I. redukční dělení (heterotypické) Profáze: leptotene zygotene pachytene diplotene diakineze • II. redukční dělení (homotypické) mitóza haploidních buněk FILM Meióza I Anafáze I • Homologní chromosomy oddeleny a putují směrem k pólům. • Sesterské chromatidy zůstávají spojeny svými centromérami. Telofáze I • Každý pól obsahuje haploidní sadu chromosomů. • Cytokineze a vznik 2 haploidních dceřinnýchbuňek. Meióza II • BEZ interfáze II nebo velmi krátká (bez replikace DNA, nezdvojuje se!) • Meióza II je podobná mitóze (jen k ní dochází za haploidní sady chromozomů) Metafáze II • Jako metafáze u mitózy Anafáze II • Jako anafáze u mitózy • Sesterské chromatidy se oddělují Telofáze II • Jako telofáze u mitózy • Formace jádra • Začátek cytokineze • ! Vznik 4 haploidních dceřiných buněk • gamety = spermie nebo vajíčka Meióza Meióza VARLE (TESTIS) Funkce: produkce spermií, produkce hormonů Mikroskopická stavba: Tunica albuginea testis – tuhá pouzdro z kolagenního vaziva Tunica vaginalis – naléhá na t. a. t. ze zevní strany, serózní obal Tunica vasculosa – tenká vrstvička, řídké kolagenní vazivo, krevní cévy Mediastrum testis – na zadním obvodu, zesiluje t. a. t. Septula testis – tenké vazivové přepážky, vybíhají z t. a. do varlete, rozdělení varlete na 200 -300 lalůčků = lobuli testis V lalůčcích stočené semenotvorné kanálky – tubuli seminiferi contorti, v každém lalůčku 1 – 4 kanálky – vystlány ZÁRODEČNÝM EPITELEM Intersticium varlete – řídké kolagenní vazivo – fibrocyty, migrující buněčné elementy…, endokrinní intersticiální Leydigovy buňky – produkce testosteronu SEMENOTVORNÉ KANÁLKY Šířka – 0,2 mm, délka 50 – 80 cm, mnohonásobně stočené Stavba: - zevní vazivová pochva (kolagenní a elastické fibrily, fibroblasty) - bazální membrána - zárodečný epitel – vícevrstevný, spermatogenní buňky, podpůrné buňky = Sertoliho buňky (velké buněčné elementy, nasedají na BM, zasahují až k povrchu epitelu, velké nepravidelné jádro, v apikální části cytoplasma obklopuje hlavně spermatidy – dozrávání, přeměna na spermie) Embryonální období: nediferencované kmenové buňky = gonocyty se diferencují na semenotvorné buňky = spermatogenní, intenzivní proliferace Po pubertě: začíná plynulá spermatogeneze, během BC se postupně diferencují 3 typy spermatogonií. • Spermatogonie A – tmavá, dočasně neproliferující, rezervní funkce • Spermatogonie A – světlá, pokračuje v proliferaci, opakovaně BC, udržuje se konstantní populace těchto buněk v zárodečném epitelu • Spermatogonie B – zahajuje diferenciaci, vyčlení se z BC a zahajuje SPERMATOGENEZI. Spermatogonie: - malé, okrouhlé buňky, uložené u BM - jediný typ buněk, který se vyskytuje i před pubertou - okrouhlé jádro se skvrnitě uspořádaným heterochromatinem - před dělením diploidní (2n) počet chromozómů - 46, 2N – diploidní množství DNA SPERMATOGENEZE Vývoj od nediferencované spermatogonie po zralou spermii (cca 64 dní), závislost na testosteronu • SPERMATOCYTOGENEZE Rozmnožování buněk mitoticky a meioticky • Perioda rozmnožování Ve stádiu spermatogonie, intenzivní mitotické dělení, přes 2 typy spermatogonií A, spermatogonie B – zahajují vlastní proces spermatogeneze • Perioda růstu Spermatogonie B – dlouhá S-fáze BC, diferenciace na: Primární spermatocyt: - největší buňky zárodečného epitelu, blíž lumenu - diploidní sada chromozómů 46, množství DNA 4N - velké okrouhlé jádro s tmavými proužky heterochromatinu (smotaná nit) - pozorujeme je v profázi 1. meiózy (až 22 dní) 3. První zrací dělení (meiotické) Profáze I: Leptotene – ztlušťování chromozómů Zygotene – chromozomy tvoří homologní páry Pachytene – chromozomy se zkracují a ztlušťují Diplotene – synapse chromozómů, crossing-over Diakineze – oddělování chromozómů Metafáze I: chromozomové páry se připojují na vlákna vřeténka Anafáze I: ch. páry putují k pólům, chromatidy v každém chromozómu zůstávají spojené Telofáze I: haploidní sady ch. se oddělují a buňka se rozdělí na 2 sekundární spermatocyty (22 + X, 22 + Y) Sekundární spermatocyt: - Produkt 1. meiotického dělení - Leží ještě blíže k luminu, na řezech vzácně, po vzniku hned zahajuje 2. meiotické dělení - Asi poloviční než primární spermatocyt - Haploidní 23, DNA 2N 4. Druhé zrací dělení Navazuje bezprostředně na předchozí, probíhá podobně jako mitóza Výsledek: 4 spermatidy - haploidní počet chromozómů (22+X, 22+Y, 22+X, 22+Y) - DNA – N - uloženy kolem luminu - malé buňky,tmavá jádra, hodně heterochromatinu Pozn. během procesu diferenciace zárodečných buněk od spermatogonií až po spermatidy – tyto buněčné elementy spojeny plazmatickými můstky, samostatné až spermie B. SPERMATOHISTOGENEZE (SPERMIOGENEZE) - Buňky se již nedělí - Spermatidy se diferencují na zralé spermie - Probíhá v apikální části cytoplazmy Sertoliho buněk (obklopuje tyto buněčné elementy, dodává výživu) - Jader. chromatin silně kondenzuje, jádro se mění na hlavičku spermie - Z Golgiho komplexu vzniká plochý váček – akrosom (přikládá se na apikální část jádra) - Centrioly se stěhují do krčku, proximální centriol – k bázi hlavičky, distální tvoří bazální tělísko axonemy – osového vlákna - Zralá spermie: hlavička, střední oddíl (krček, spojovací oddíl), bičík (hlavní část, terminální část) Spermatogeneze OOGENEZE VAJEČNÍK (ovarium) „Zárodečný epitel“ – na povrchu vaječníku, jednovrstevný, plochý až kubický Tunica albuginea – nepřesně ohraničená vrstva hustého kolagenního vaziva Kůra vaječníku – řídké kolagenní vazivo, uloženy v něm ovariální folikuly a jejich deriváty v různém stádiu oogeneze Dřeň vaječníku – husté kolagenní vazivo Perioda rozmnožování: Z primordiálních zárodečných buněk – oogonie; množení mitotickým dělením Perioda růstu: Vznik primárních oocytů, + folikulární buňky = primordiální folikuly Primární oocyty – vstup do prvního zracího meiotického dělení POZOROVÁNÍ EPITELIÁLNÍCH BUNĚK Z DUTINY ÚSTNÍ + BARROVO TĚLÍSKO BARROVO TĚLÍSKO (sex chromatin): Barvitelný útvar, který lze nalézt v interfázním jádře somatických buněk samic savců. Jeden z dvou pohlavních chromozómů X je trvale ve stavu heterochromatinu, tzn. je trvale kondenzovaný, tzn. nepřepisuje se. Dříve: k určování pohlavních odchylek. Př. Klinefelterův syndrom AAXXY Turnerův syndrom AAX.. POZOROVÁNÍ EPITELIÁLNÍCH BUNĚK Z DUTINY ÚSTNÍ + BARROVO TĚLÍSKO Odkazy • Flash animace meiózy: • http://www.stolaf.edu/people/giannini/flashanimat/celldivision/meiosis.swf • http://www.johnkyrk.com/meiosis.html • mitóza vs. meióza: http://www.pbs.org/wgbh/nova/baby/divide.html