Biologie vitaminu A a jeho úloha ve fyziologii živočichů E-mail: jipa@sci.muni.cz Tel: 532 146 223/116 |!> ľ i ni nur iľ symmetric / B retifipl / \ ^ \ asymmetric rctinol rulinvlestcr sloragc X^X^OvAUH |J-apt*-[0''Ľflrotcnal 6^° \i-ÍOOOIK ftliľKiii; acid ^>-^V conn ;i-: jí; -j -U.-.J ŕ-ijľjĽv ^^ »írinal lllIttOiť KJd minal retinil 3-kvdraxy-rdmil 3-^jrd taxy - [ oC ino 1 pLltlli nj;imoi,iLí arfbropwHls RETINOIDY Vitamin A jsou obecně lipofilní látky podobné struktury a aktivity (retinol, retinal, kyselina réti nová) Prekurzory retinoidů jsou karotenoidy, zejména Hcaroten (~ 50 z >400 je využitelných) Nejdůležitějším derivátem je kyselina retinová (RA), odvozená od retinalu retiny I estery <-> retinol <-> retinal <-> kyselina retinová (vit. A) (RA - retinoic acid) - Tělo je přijímá v potravě, karotenoidy v rostlinné, vitamin A a jeho deriváty v živočišné Retinol equivalent (RE) = retinol v potravě (ug) + RE u žen ~ 800 Hna den RE u mužů ~ IOOOM na den [a rote n 6 + ostatní karotenoiď Natural Retinoids i-j OH RETINOL (Vitamin A) .13 ALL-TRAN 5~R ETI NOIC ACID H ■i OH ALL-TRANS^-HYDROXYRETINQL ALL-TRANS^-HYDROXYRETINOIC ACID n OH J ALL-TR AN &-4-OXORETINOL OH OH 14-HYDROXYL-4,14-RETRORETINOL O ALL-TfiANS-4-0X0 RETINOID ACID COOH 3,4-OIDEHYDRORETINOIC ACID Ross, 2000 O^OH S-CISRETINOICACID Distribuce retinoidů v organismu Retinoidy jsou resorbovany v tenkém střevě, v enterocytech se karotenoidy mění na aktivní retinoidy (retinyl estery), s lipidy a dalšími lipofilními látkami tvořícími chylomikrony jsou uvoněny do lymfatického systému odkud se postupně uvolňují do celkového tělního oběhu. Zásoba je vytvářena v játrech (50-85% celkového) v lipidových kapénkách ve hvězdicovitých buňkách jater. retinyl estery supraclavicular nodes \j-ý—inguinal nodes Distribuce retinoidů v organismu - 90% retinoidů je v těle v podobě retinyl esterů v lipidové složce chylomikronů, část jich může být i přímo v buněčných membránách. - beta-karoteny mohou být navíc uloženy v tukové tkáni - v případě potřeby (mobilizace zásob) je retinol uvolňován z jater do krve, vázaný s v hepatocytech syntetizovaným proteinem RBP (retinol vázající (binding) protein). Tento komplex (holo-RBP) se váže s transthy réti nem (TTR, prealbumin), čímž je zabráněno vylučování retinolu v ledvinách. Takto v plasmě cirkulující retinol je připraven ke zpracování v cílových buňkách. - K přeměně na konečné funkční retinoidy dochází až v místě spotřeby. ! Retinoidy tedy působí zejména autokrinně a parakrinně Výběr nejvýznamějších oblastí vyžadujících metabolizmus retinolu/vit.A A) fotorecepce B) růst a vývoj organismu 5 c VISION SKIN VISION THACHEA m.tWit i FPITHFLIAL Hů nir-FRF.NTIATIÚN THVMUĚ LYMPHOID ORGANS BEFTOPUCTIPN FMFIRYC.1IJAL. DEVELOPMENT ^rr CC a Ross, 2000 RETINOL METABOLISM IN ANIMALS 9-cis-Retinol Q^ DHRS4 all-trans-13,14f düiydroretinol 0^—1.3.99.23 —-v aU-trans-Retinol (ViteaniBe A) ---^=ř° + RDH 9-cis-Retinal -----*-0--------- 1.2.3.11 1.2.1.36 -►O 9-cis-Retinoate CTP26A1 [ biosynthesis CTP26 ->o 40xoretiruol ---------Carotenoid f Oß-Carotene 1.149936 AD H PNPLA4 3.1.1.21 3.1.1.64 D GAT RDH DHRS LRAT -Ô 5.2.1.7 all-trans-Retŕnyl ester RPE65 11-cis-Retŕnol :om- 3.1.1.63 3.1.1.64 D GAT RDH LRAT -O 11-cis-Retŕnyl ester Y all-trans-Retŕnal 1.2.3.11 hv 1.2.1.36 all-trans-Retiruoate -------*o Ó Metarhodopsŕn II O Metarhodopsŕn I 5.2.1.3 Iodopsŕn O QLumirliodopsiri Ô Bathorhodopsŕn hv ORhodopsŕn ->0= 11-eis Retmal CTP26 CTPIA CTP26 CTPIA CTP2ABC CTP3A CTP2ABC CTP3A CTP26 CTPIA 1 CTP2ABC CTP3A CTP4A —►O-------- all-trans-4-Hydroxy-retŕnoic acid _^q all-trans- 18-Hydroxy-retiruoic acid +*o all-trans-4-Cxoretŕnoic acid CTP2AB CTP3A _^_ all-trans-5j6-Epoxy-~^u 5j6-dihydroretiriDic acid UGT2B7 UGT aU-trans-Retŕnoyl ß-glucurorüde 00830 9ŕl6ŕ08 (c) Kanehisa Laboratories ÚLOHA RETINOIDU VE FOTORECEPCI retinyl estery <-> retinol <-> retinal <-> kyselina retinová Šidí- A) (RA - retinoic acid) rodopsin opsin ÔC W \ cytoplazma l zevního segmentu I i membrána < terčíku intradiskální prostor ->[ 11-cis-retinal ail-frans-retinal __________světelná energie all-franí-retinal fj—™ atl-rrans-reťinot 3. o *~/ 11-c/s-retinol 11 -cfe-retinal 0-\ i membrána terčíku transducin -40inV Ip ©[ ®l li;: PDE neaktivní 0 >;.cGMP/. -U^' Na+ nitrobuněč-\? n9 prostor *% týnsky e ■4-Hhr—— 3 mé ■-l«-Na+ rodopsin ß 7 GDP za tmy 4 kanál otevřen ! MR II (metarodopsin II) , P mru GTP: světlo >—-^ světelný podnět 4" cGMP klesá o .5. S 13 o c-'S -O: I 8 [Ca2+]i = 350-500nmoL ■J Ql CaM Ca3+/Na+ influx depo-laŕižace kanál uzavřen I [Ca2+] klesá hyper-polarizace fos-ducin-P adaptace na tmu ■m uvolňování glutamátu zvýšeno li sníženo \ signál: „světlo" MECHANISMUS REGULACE RŮSTU A VÝVOJE ORGANISMU RETINOIDY V regulaci ontogeneze je klíčovým retinoidem kyselina réti nová - RA, a to její izoformy all-trans a 9-cis. Fílingl .:■■■..!■■ i :i. --.i Retinal Dehydrogenase l^^k^J^™^ >^CHCL_ >C^V^^ coohI ::l lr:iii-i rilinnl ■-' I. -i ii .'i sll-ttans tellnaldenyde ^cfl"? Retinol (Vllírnln A) Extracellular Space r™™ Retinoic acid Retinůiť arid aii-iraiis relinoic und CyhwhrKřrti* PJ50 Dependent Voxn all-lrjns nclinoic ííid >O^V^-^COOH| Kyselina retinová (RA) MORFOGEN & TERATOGEN PLEIOTROPNI VLASTNOSTI V průběhu embryonálního vývoje je metabolismus RA nezbytný zejména pro formování tělní osy a segmentaci (Hoxgeny), vývoj CNS, očí, srdce, ledvin, pohlavních orgánů, a epitelů obecně. U dospělců se pak podílí zejména na udržování homeostaze imunitního systému, epitelů a zrání pohlavních buněk (spermatogenezi). Proteiny regulující účinky RA v buňce a) Enzymy Metabolismus retinoidů, zejména oxidace. a) Retinoidy vázající proteiny Zásoba v buňce, regulace jejich intracelulární koncentrace, transport. a) Jaderné receptory RA (transkripční faktory) Realizace transkripce na RA závislých i nezávislých genů. ENZYMY metabolismu RA ENZYMY -1 Retinol dehydrogenazy : oxidace RETINOLU -> RETINALALDEHYD Dvě skupiny alkoholdehydrogenáz, třída I a IV. Přitom třída I se zdá málo významná pro metabolismus retinoidů, oproti třídě IV, kterou lze detekovat v oblastech intenzivního metabolismu retinoidů od 10 dpc (myš). Pravděpodobně se ale uplatňují i membránově vázané alkohol dehydrogenazy (známe 2 co oxidují retinol), upřednostňují však pouze 9-cis isomery. ENZYMY - II 2) Retinaldehyd dehydrogenázy : oxidace RETINALDEHYDU -> KYSELINU RETINOVOU Tato reakce může být katalyzována i aldehyd nebo xanthin oxidázami, ale převážně je řízena retinaldehyd dehydrogenázami. Byly identifikovány 3 typy, RALDH, které s liší specifitou k retinaldehydům a distribucí v organismu. RALDH1 (=AHD2, ALDH1) ačkoliv je relativně málo aktivní, je silně exprimován v retině, a tak prakticky všechna RA v retině je produktem tohoto enzymu. Dále je během embryogenéze exprimován ve středním mozku (mesencefalon) a v corpus striatum. Váže také androgeny a je možné, že tak zprostředkovává interakci mezi RA a androgenními jadernými receptory. RALDH2 je vysoce selektivní k retinaldehydům. Začíná se exprimovat již v průběhu gastrulace A odpovídá za produkci RA ve všech tkáních závislých na RA (mozek - zejména motoneurony, mícha, srdce, ledviny, pohlavní orgány,...). RALDH2 -/- embrya hynou v důsledku neuzavření nervové trubice a poruch ve vývoji srdce, přídavkem RA, lze tyto efekty potlačit. RALDH3 (=V1) je sice vysoce aktivní enzym, ale málo specifický k oxidaci rentinaldehydům. U časných embryí je exprimován ve ventrální části retiny a v gangliích koncového mozku (telencephalon). Později je přítomen zejména v játrech a kůži. Společně s RALDH1 u embryí katalyzuje přeměnu gamma-aminobutyraldehydu na GÁBA. ENZYMY - III CYP26 (=P450RAI) : oxidace KYSELINY RETINOVÉ -> KYSELINU 4-OXORETINOVOU (Hydroxyláza kyseliny retinové, dvě formy CYP26A1 a CYP26B1) CYP26 je členem velké rodiny cytochromu P450. V současné době je jediným známým enzymem katabolizujícím RA. Exprese CYP26 je indukována RA, a je přítomen minimálně ve všech buňkách s metabolismem RA a v buňkách citlivých k působení RA. Jeho podíl na deaktivaci RA není však plně objasněn. Např. u žab, 4-oxoRAje silným aktivátorem receptoru RA a tak i buněčných regulací citlivých k RA. Je pravděpodobné, že enzymů metabolizujících retinoidy je více, avšak s menším významem než výše jmenovaní. Jejich exprese, podobně jako syntéza RA je v průběhu embryonálního vývoje velice dynamická v závislosti na typu tkáně a vývojovém období. Obecně je souhra v jejich expresi a aktivitě nezbytná pro segmentaci (zejména regulace Hoxgenů) vyvíjejícího se embrya. Retinoidy vázající proteiny Váže retinol i retinaldehyd a chrání je před oxidacemi a světlem. Retinol vázaný na CRBP-1 však může být oxidován na retinaldehyd retinol dehydrogenázou. Uvolněný retinaldehyd je pak přístupný pro oxidaci RALDH na RA. b) Buněčný RA vázající protein (CRABP - cellular RA binding protein) CRABP-I chrání RA před další metabolizací podobně jako CRABP-II, který je však přítomen nejen v cytoplasmě, ale i v jádře, asociuje s receptory pro RA a slouží tak i jako transkripční regulátor / kofaktor. Je zajímavé, že absence CRBP a CRABP (knock-out myši) má minimální účinek na fenotyp organismu, na rozdíl od vypnutí některého z enzymů (viz. výše) nebo receptoru (viz. níže). Retinoidy vázající proteiny Meaalin (gp330 / LRP-2) - patrří do rodiny LDL (low-density lipoprotein) receptoru. Je exprimován v membránách zejména epiteliálních buněk a slouží jako receptor pro RBP a retinol (a také sonic hedgehog (Shh)). Megalin zprostředkovává transport retinolu (vázaného jak na RBP tak LDL) skrze vrstvy epiteliálních buněk, ale i do jejich intracelulárního prostoru. V ledvinách se podílí i na transportu dalších lipofilních vitaminů (např vit. D + vit. D vázající protein, vit. B12 + transcomalamin). Komplex ligand - megalin je pohlcen procesem endocytózy a vzniklý endosom cestuje buňkou na místo určení. Receptory RA Receptor RA = RAR = retinoic acid receptor (RAR|(rA RAR je aktivovaný jak all-trans RA, tak 9-cis RA Receptor retinoidu X = RXR = retinoid X receptor (RXR RXR je aktivovaný pouze 9-cis RA RAR|t- isoformy) RXR^ isoformy) Geek Mijar imforrni l.'.hrECTimicimjJ lociiLan* Lifpnd KuriMit Möwe RARß al,a2 ITi^l.l HD dl-Cnuu 1 HARß ßt.pi.rä.lrt >i.:v 14 h 4nd RARy tl.tf l2qLJ 15 ^cy Í1A RJCHn ttl.02 9qMJ 2 RXHß PI.PÍ tip21.4 17 ^r«ÄA RXR} yi.ip LqZľ qltt 1 RA receptory patří do rodiny jaderných receptoru společně s receptory thyroidních hormonů, receptorem vit. D, receptory aktivujícími peroxisomové proliferátory (PPARs), jaterním X Receptorem (LXR), farsenoidovým receptorem (FXR) a se sirotčími (orphan) receptory. S těmi zde jmenovanými RXR tvoří také heterodimery regulující transkripci mnoha ontogeneticky významných genů. Regulace genů řízených RA je zprostředkována jejími receptory, které zároveň slouží i jako transkripční faktory. Vytvářejí funkční homo (RAR/RAR, RXR/RXR) i heterodimery (RAR/RXR), přičemž heterodimery jsou výrazně transkripčně silnější/aktivnější. Jejich kombinace (48) jsou specifické pro konkrétní promotorové sekvence (response elements) v promotorech RA indukovaných genů. transkripčni faktory transkripce on /off ? DNA Příklady promotorových sekvencí s RAR/RXR vazebnými místy Natural rp-Hnau: arid wsyícrtise eíťwrttfe' 1) mtíAIind 2) hCIAKnri -3) mtíAIiítí í 3 hllAllffc? j) lil l AI 1-/2 fl) hAWhi 73 ml'HßPI #3 m Lam [31 9) hapoAt Jf?3 rnCP-tl í£) hfclfAE) /■í) hLacLoforrln rompoHlLa plameni IIAIIK EHE Jí) mCJlAHPn RAHE1 liAliKi /:j) ľMÍPl'K IIAIIK I HAUE* iff) rn"R3flKi([rfJľlGHHEl) Í73 mJ/turl.S Jď) roJVarb-l JS|) taffoato-l Jfli ni STAT I ' <-S9)GGC'G AGTTCAGC AAGAGTTC AGťt'GA[ -M >:3' (1 :B) S'^S^GGťGAGTTCAGCGAGAGTTCAGtTGC'í-^-ä' [174) E' <-B7)GAAGGGTTC!áCK3AAá£TTCACTCGC(-32)-3" (273) E,<-E73CiTAiiGGTrCAi,t:GAAAGTrCAJt,Tt,i3t,.(-:yj-:3' [IE, 80} V <-l 01 Jtitifl'GGGTCAÍ 3i 3AGť 3AGGTGAGCGCGC(-375)-3' [171) V<-iS03ACAGGGGrrcATTCAGAGTTCAi:31TTT(-30E3-:ľ (EŮ) V <-l 01E)TAGTAGGTCAAAAGGTCAÍ ;ATAG(JQM )-3' (2SB) E^-däEjGAGGTGAGCTAGGTTAAGC'ťt^TTAGAA AAAGGGTCAA(-d6B)-3' [290, £S1) 5" <-!US JAGGt; CAi I GGGTCAAC3 GGTTCAGTÍ 3GG( -217>:J1 [233) E' <-l 17)CAGCAGGTC Ať Ti 3 AC1 AGGGC ATAGVA(-12£ J-:3' (19G) E'-OGBSJGrTGTCACAGGTCAľAGGTCAľ AGGTeAľAGTTCAÍ-GOE)-:?' (182) E'^l^GGGTTTGAC^TTTť.Tr.TCr GGGTAAAGGTGA\í:;í;(-30S)-:3, 3'-CCCAAACT^GGAAA(3AGAGGCCCATTTt,rAt,TTt.,(.■-^■ (223) ■i-tlM .AA:3, (IM) SH^liGATCCGTCCCGGOC^AGCCCTtiTCt'T TGACCXXXACCTGACAATTAAGÍ3ťAAÍiAGtXT[-29E>:i (2-4-1. £713 E'-(-170:3)C,ATCiGGGGTCACTGTGAGAGGTCCC,A(; TGGGG,TCAÍ3Í3ATTA(-17B1>Ü, anLIbanae (199) ij'-aiihancpr E,-[Sac-74 X'AGGTTTCAt'C'GAAAGTTCAAÍ^Sac-EE)-:}1 (128} :3'-enhancpr E,-t,TTAGAGGTAAAAAGGTCAGCCC!AG-3, [169, 209) E'-rcpn^bor V-AGGGCAAi ;AGTT0A-:J' [16Ö, £69) V -(-27-1 jTCli AGATGGGTC AGGGTG AVAAťf -£ r^>:3 ■ (1 li) 21) rDqpamlrie lh receptor EX^ljCXTniTGGOCAGGGTGACCCCX-El)-:?' (£33) Cůmr-nuja G T 5r- G T C A A G 1 2 3 I E ij A T [X) G T ľ A-:3' G G I 2 3 -1 ľ> G Ross, 2000 Srovnání některých defektů vyvolaných nedostatkem RA (RAD), oproti vyřazení jednotlivých receprotu RAR nebo RXR IUI) llAllfi/y B£BůQ2 IÍAi;uU-}<7) ílXílr IÍAliir.'lŕXI.Lr lij\liy'N\lir Pí 1 "i ■: - i "■ • | :• 111J i :-l 11111 :-l + •- +'1 NH" +* l/ms olongaLlon/fiboi: anomaly + •'■ - - - - — l/'iľH coll apoploslü + NH Nli Nli NE Nli NH NcillTll IH'MllM Hfi'ipliiSlS + NH NH + NE Nli NH 11ilivlil-I 1 n:-3l gap + + " — +•■ - + •■ += Abwill ein mild fiwiino + - - - - - - Thlekonod pmcomoal almma + + - • ■' + - ■1- Mow1 do locus + + + - + + ■h Aliiinľiii.'il H m h i-JĽijy. + + - - - - - Abíionl 1 i^ehoal-OMjpliagoal BOfJlum + - - - - - - Ahsonl civuilaJ floxu iio + - Nli NH NE Nli NH 11 ead w i d i lo iTous sy>il om íllndbialn dofoclis + + ľ - - NH Nli NH ľ n ml" mihmi] hvpi if jIslsIh, coll doaJli + + - - - - - MajidltjLilarhypoplaala, coll doaLh + - - - - - - Cranial noLvo hypoplasia, atsjonco - •ľ - - NH Nli NH Grain liyfioplasLa -t* •'■ — — - — — r ± Indlealm no.Unal * 'H i liming of marginal Nli, nol iioportjo.d oľ aaaoysod. a Also ymallor vonLraJ loLIna Nol dolallod; ono lnsLanoo oľ ab&o.nl loiu? ovoiylon, no obvious gap. RAR! indukují degradaci daných receptoru) &W _ Rerinok iiťld Inhibice AP-1 zprostředkované transkripce kyselinou retinovou AP-1 transcription AIM transcription RA-nesponii^e enhancer sequence AP-1 responsive enhancer suqjhíncť ŕ Gene B Repression of íťi] division bind production of Serinové a threoninové zbytky fosforylované ( ) u RAR/RXR receptoru, ukázány jsou i potencionálně fosforylovatelné(čísla) AF-1 DBD LBD/AF-2 EEIVPS74PP ppplpr EELVPS67PPS70PLPPPR eemvpS 36pS38pppppr MAPKs + cdkľ RKRRPS j9RP rkrrps362kp rrrrpS 50qp RAR »j EEMVPS 77PS79PPPPPR AF-1 DBD RRRRPS QP LBD/AF-2 SSSLNS22PTGR....S44P. S48p.. S54p... SS61P.. SS75P..PTT87P S96P..S101P lnpS 35pndp AF-1 (A/B doména) - oblast regulující aktivaci transcripce, nezávisle na ligandu DBD (C doména) - DNA vázající doména (DNA-binding domain) LBD/AF-2 (D/E doména) - oblast regulující aktivaci transkripce, závislé na ligandu JNK1 + JNK2 Systém pro detekci RA v buňkách/tkáních (RARE-LacZ reportér) další faktory/sekvence nezbytné pro funkci promotoru Exprese a aktivita RALDH-2 v mozku myšího embrya (16 dpc) A) In situ hybridizace mRNA RALDH-2 B + C) RARE aktivita (RARE-LacZ reporter) Detekce epxrese CYP26 (in situ mRNA hybridizace) v retině (A) a RARE aktivita (RARE-LacZ reporter) v embryonální retině (čelní a zadní pohled)(B) McCaffery, 2000 Literatura ke studiu 1. Clagett-Dame, M., and L. A. Plum. 1997. Retinoid-Regulated Gene Expression in Neural Development. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression 7:299-342. 2. Clagett-Dame, M., and H. F. DeLuca. 2002. The Role of Vitamin A in Mammalian Reproduction and Embryonic Development. Annu. Rev. Nutr. 22:347-381. 3. Maden, M., and M. Hind. 2003. Retinoic Acid, A Regeneration-Inducing Molecule. Developmental Dynamics 226:237-244. 4. McCaffery, P., and U. C. Drager. 2000. Regulation of retinoic acid signaling in the embryonic nervous system: a master differentiation factor. Cytokine & Growth Factor Reviews 11:233-249. 5. McCarthy, R. A., and W. S. Argraves. 2003. Megalin and the neurodevelopmental biology of sonic hedgehog and retinol. J. Cell Science 116:955-960. 6. Napoli, J. L. 1999. Interactions of retinoid binding proteins and enzymes in retinoid metabolism. Biochimica et BiophysicaActa 1440:139-162. 7. Rochette-Egly, C, and P. Chambon. 2001. F9 embryocarcinoma cells: a cell autonomous model to study the functional selectivity of RARs and RXRs in retinoid signaling. Histol Histopathol 16:909-922. 8. Ross, S. A., P. J. McCarffery, U. C. Drager, and L. M. De Luca. 2000. Retinoids in Embryonal Development. Physiological Reviews 80:1021-1054. Shulman2005 RXR x metabolic syndrome