Oxid dusnatý Antonín Lojek Kromě mnoha literárních pramenů byla k přípravě použita také přednáška Dr. Hampla - FN Motol. (http://physiology.lß.cuni.cz/hampl/teach_slides/no_slides/index.htm) Oxid dusnatý ( = nitric oxide = NO) NO je molekulou složenou z 1 atomu kyslíku a 1 atomu dusíku Tyto atomy jsou vázány dvojnou vazbou Na atomu kyslíku se nacházejí 2 páry elektronů (nevazebných) Na atomu dusíku se nachází 1 pár nevazebných elektronů a jeden elektron n e párový Molecular formula NO Structural formula N = 0 Molecular models Space filling Ball-and-stick NITRIC OXIDE Nitric oxide (NO), a colorless gas that turns brown when it contacts air, is a known pollutant and component of cigarette smoke and automobile exhaust. But in the body, NO is a chemical messenger with a role in the relaxation of smooth muscle cells. Atmospheric Nitrogen Oxides Los Angeles l Něco málo chemie o NO NO je radikál (lichý počet valenčních elektronů, konkrétně 11 - o 1 víc než N2, o 1 míň než 02) to, že je to radikál, se někdy zdůrazňuje tečkou (NO), to ale není nutné, "radikálovost" je implicitní v označení NO z N2 a 02 se tvoří jen za specifických podmínek při vysokých teplotách, např. při blesku; taky vzniká ve spalovacích motorech a tepelných elektrárnách samovolně se nerozkládá, jen za vyššího tlaku - při něm pozvolna vzniká 2-3 % toxického N02 za měsíc (pozor na skladování v bombách!) poměrně málo rozpustný ve vodě (-1.7 mmol/1 při 25°C), t.j. řádově podobně jako 02 či N2 Oxid dusnatý • ještě před pár lety pouze nepříjemné a nebezpečné znečištění ovzduší přispívající ke smogu a kyselým dešťům, dnes nejstudovanější endogenní molekula posledních 20 let • explozivní rozvoj znalostí (cca 300 nových publikací měsíčně) • nové téma, ve starších učebnicích chybí • "Molekula roku" 1992 prestižního vědeckého časopisu Science • účastní se funkce všech hlavních orgánových systémů • během několika let postup od základního objevu k významným klinickým pokrokům (PPHN, ARDS, šok, impotence) Persistent Pulmonary Hvvertension of the Newborn http://www.persistent-pulmonary-hypertension-newborn.com/ Persistent pulmonary hypertension of the newborn (PPHN) occurs when a newborn's circulation system does not adapt to breathing outside the womb. While a fetus is in the womb, it gets its oxygen from its mother's placenta through the umbilical cords, so the lungs need little blood supply. In PPHN the newborn's arteries to the lungs remain constricted after delivery, limiting the amount of blood flow to the lungs and therefore the amount of oxygen into the bloodstream. Acute respiratory distress syndrome http://en.wikipedia.org/wiki/Acute_respiratory_distress_syndrome Acute respiratory distress syndrome (ARDS), also known as respiratory distress syndrome (RDS) or adult respiratory distress Syndrome (in contrast with IRDS) is a serious reaction to various forms of injuries to the lung. ARDS is a severe lung disease caused by a variety of direct and indirect issues. It is characterized by inflammation of the lung parenchyma leading to impaired gas exchange with concomitant systemic release of inflammatory mediators causing inflammation, hypoxemia and frequently resulting in multiple organ failure. This condition is often lethal, usually requiring mechanical ventilation and admission to an intensive care unit. HISTORIE 1620 - NO prvně připraven Belgičanem Janem Baptistou van Helmontem (t.j. dříve než třeba kyslík - 1774) 1772 - chemicky charakterizován Josephem Priestley em (objevitel kyslíku) 1800 - toxicita (Sir Humphry Davy se málem zahubil, když to zkoušel dýchat) 1867 - amylnitrit snižuje krevní tlak při hypertenzi (dnes víme, Že to dělá tím, že uvolňuje NO), (poppers). 1914-1918- dělníci plnící za první světové války nitroglycerin do dělostřeleckých granátů měli velmi nízký krevní tlak, což vedlo k zavedení nitroglycerinových tablet pro úlevu při angine pectoris; dnes víme, Že účinek amylnitritu i nitroglycerínu je zprostředkován oxidem dusnatým uvolňovaným z těchto látek 1977 - NO aktivuje guanylát cyklázu a tak zvyšuje intracelulární koncentraci cGMP (Ferid Murad) 1980 - objev endoteliálního relaxačního faktoru (EDRF, Robert Furchgott). Snaha identifikovat EDRF vedla bezprostředně k objevu, že EDRF = NO 1987 - schopnost eukaryotických buněk tvořit NO: Louis Ignarro, Salvador Moncada 1998 - Nobelova cena za fyziologii a lékařství: Robert F. Furchgott, Louis J. Ignarro, Ferid Murad (Mza klíčové objevy týkající se NO jako signální molekuly v kardiovaskulárním systému") (Moncada cenu nedostal, přestože to mnozí čekali) (Alfred Nobel vydělal na Nobelovy ceny tím, že vynalezl dynamit, založený na nitroglycerínu, sám trpěl ICHS, předepsali mu nitroglycerin, Nobel to považoval za ironické) v přítomnosti kyslíku podléhá autooxidaci za vzniku N02: 2 NO + 02 --> 2 N02 autooxidace je asi 200x rychlejší v roztoku než v plynné fázi autooxidace je rychlá (několik sec), je-li NO i 02 hodně, ale celkem pomalá, je-li NO málo - jako je tomu většinou v tkáních, kde je NO méně než 10 uM (poločas NO tam může být až 500 sec) ve vodném roztoku jsou produktem autooxidace nitrity (N02~), pouze v přítomnosti hemoproteinů proběhne oxidace až na nitráty (NO3-) v přítomnosti superoxidu vzniká extrémně rychle peroxynitrit: NO + 02- --> OONO "OONO není radikál, aleje velmi reaktivní a cytotoxický NO je velmi rychle inaktivován oxidací s železem oxyhemoglobinu za vzniku N03" Furchgottuv sandwich Furchgott prokázal že relaxace cév indukovaná acetylcholine™ je závislá na endoteliu. Použil dva kousky aorty, u jednoho odstranil epitelium frcsüure &uuge* -** Contraction curve Endölhfiliujn presem -Kctykholin« iwuIk ni rt tasal inu ACh A relaxing factor from Ihc cudothc' li um * FhRF - W» discovered Robert F Furchgort 1916 Dept. of Pharmacology, SUNY Health Science Center New York NAs Naftklivrvilľir Acetylcholine (http://en,wikipedia,org/wiki/Acetylcholine) Acetylcholine has functions both in the peripheral nervous system (PNS) and in the central nervous system (CNS) as a neuromodulator. In the PNS, acetylcholine activates muscles, and is a major neurotransmitter in the autonomic nervous system. In the CNS, acetylcholine and the associated neurons form a neurotransmitter system, the cholinergic system, which tends to cause excitatory actions. In PNS In the peripheral nervous system, acetylcholine activates muscles, and is a major neurotransmitter in the autonomic nervous system. . When acetylcholine binds to acetylcholine receptors on skeletal muscle fibers, it opens ligand gated sodium channels in the cell membrane. Sodium ions then enter the muscle cell, stimulating muscle contraction. Acetylcholine, while inducing contraction of skeletal muscles, instead induces decreased contraction in cardiac muscle fibers. This distinction is attributed to differences in receptor structure between skeletal and cardiac fibers. Ignarrova spektrálni analýza Ignarro pomocí spektrální analýzy prokázal, že EDRF je totožný s NO. Hemoglobin (žlutý) exponovaný endoteliáíním buňkám produkujícím EDRF (konverze oxyhemoglobin u na methemog lobin}. Hemoglobin (žlutý) exponovaný přímo NO. Posun \/ absorbční křivce je identický (EDRF = NO), Louis J Ignarro 1941 Dept. &f Molecuterand Medír-al Pharmscofogy Mediane Lo& Antjeles Muradova enzymatická aktivace Murad věděl, že nitroglycerín působí relaxaci hladké svaloviny. Enzym guanylát cyklasa byla aktivována a indukovala zvýšení cGMP s následnou ralaxací svalu. Působí nitroglycerín cestou uvolňování NO ??? Probublával NO přes tkáň obsahující enzym - cGMP se zvyšoval. cGMP Feríd Murad 1036 Dep:, of Integrative Biology Pharmacology and Physiology University of Texas Medical School, Houston Myosin (relaxation) Guanylyl cyclase (GC) activated GC cGMP: snižuje intracelulární koncentraci Ca2+, v hladkém svalu přímo inhibuje kontraktilní aparát - cGMP je inaktivován cGMP- fosfodiesterázami na 5?-GMP (selektivním inhibitorem PDE V je třeba zaprinast - slibné pokusy s klinickým využitím; taky Viagra) V savčích buňkách je NO tvořen oxidací terminálního guanidino dusíku L-argininu molekulárním kyslíkem; kromě NO vzniká L- citrulin L-arg + 02 --> NO + L-cit M Y MADPH NADPH H3N'"cOO L-Arflinírw -Nooe y ^XJOO NG-Hydroav-L-Arciinine L-Citrulline N=0 Nitric Celou komplexní reakci katalyzuje jediný enzym, NO syntáza, která existuje ve 3 isoformách Syntásy oxidu dusnatého • neuronální syntása oxidu dusnatého (NOS1 = nNOS) • inducibilní syntása oxidu dusnatého (NOS2 = iNOS) • endothelials syntása oxidu dusnatého (NOS3 = eNOS) Každá z těchto syntáz: • má rozdílnou tkáňovou distribuci ■ lokalizovaná na různých chromozomech Name L__________________________i ľ r. 1 Present in Niiiirar.il MOS (nN03orH051 Inducible NOS (INOSÜJ-NOS2) Cmíral and peripheral neurons, platelels. pancreatic ß cells, HpithfillBl crI-s Macrophages. endotheiBJ cells-, cnonarocvtej. nepatocyies. smocth musce cells Endothelial NOS (ůNQĚíir Nl>ě3oí coT5ti:u:ivc.' cNOS) Endothelial cells, neurons, cardiac myocytes Stimuli MMDA. insulin, thrombin Endotoxin. IFN-v, ILL TNF Q ftĽäCyEílXHine, AOP. ü*irombin, shear sfress, VEGF Description Produces MO in neuronen tssufr in bolhlho central ond periphera.' norveus system. Neuronal NQ5 also perfpims 9 rple in cell communication and i& aesncialed with plasma nigmbranes. nNOS actio« can ba inhibited by N PA (N.prcpyl-L-arginirie). Can b« found In He immune eyslem but it also found in the eardnovascuar system. It usee Ihe oddati« slress of NO (a free radical 10 be used bf macrophages io Immune defence egainal pafliDůeris. Genantes NO :n blood vessels and is n'/olvsd with ragulalhg vascular tirdion. Aconslilulive Ca2 *■ důcůridínl NOS p'iwidoj a basal rcf caíu of NO c KIDS is aesccialad wilh plasma íjismuianes surrounding cells and the mcnribranas oFGolgi bodies wiltiin calls. Všechny 3 isoformy NO syntázy: Arginine jsou aktivní jako homodimery obsahují v aktivním centru hem jsou stereospecifické (D-arginin není substrátem) ^/ Cltrulllne NADP* NADPH / CHralline jako kofaktory vyžadují: NADPH, 6(R)-5,6,7,8-tetrahydrobiopterin, FAD, FMN a kalmodulin (ten se k NOS typu I a III váže po navázání Ca na kalmodulin, NOS II váže kalmodulin trvale) UCINKY NO NA CÍLOVOU TKÁN při velkých množstvích obvykle převládá oxidace (02, 02_) za tvorby vysoce reaktivních, cytotoxických produktů (ONOO) - zabíjení i jinak obtížně zlikvidovatelných baktérií (např. Mycobacterium tuberculosis), hub, parasitů a tumorů, inhibice replikace virů v nižších koncentracích je oxidace pomalá, většinou převládá regulační působení prostřednictvím aktivace solubilní isoformy enzymu guanylat cyklázy (heterodimer obsahující hem, s kterým právě NO interaguje) aktivace guanylat cyklázy zvyšuje v cílové buňce koncentraci cyklického guanosin-3',5'-monofosfátu (cGMP), ten zprostředkuje účinky NO FYZIOLOGIE NO Neurotransmitter - učení, paměť, spánek, bolest, deprese Zabíjí viry, baktérie, parazity, tumory (iNOS; indukci inhibují kortokosteroidy) Inhibuje mitochondriální respiraci Vazodilatace závislá na endotelu (ACh, eNOS) Nejvíc NO se dělá v nose a paranasálních dutinách - Pravděpodobně důležité pro jejich dezinfekci - NO lze dobře měřit ve vydechovaném vzduchu - Malá část vydechovaného NO pochází z dolních dýchacích cest (lze měřit odebíráním vzorků z úst) - mění se při některých nemocech, např. astma) NO sensitizuje presynaptický neuron k silnějšímu signálu. To následně vede k silnější odpovědi postsynaptického neuronu. Příklad: koncentrace NO ve vydechovaném vzduchu zdravých lidí. Hodnoty jsou nejvyšší při odebírání vzorků z nosu a podstatně nižší v ústech a distálnějších úsecích dýchacích cest. V periferní průdušce je koncentrace NO pod detekčním limitem vysoce citlivé chemiluminiscenční metody (Chest 110: 930-938; 1996). Chemiluminiscenční přímá metoda ■ ■*— Ozone C hem i l u mi nescence reaction Reaction^ chamber Sample capillary Vacuum Photon counter NO + O. -► N02 + 02 + light Detekce NO - cell-permeabilní fluorescenční indikátory (4,5-diacetate (DAF-2 DA) diaminofluorescein - celková koncentrace nitrátů/nitritů - aplikace NO donorů compounds, NO scavengeru, a guanylyl cyklásy - NOS aktivita v buněčných homogenátech měřením enzymatické konverze argininu na citrulin během tvorby NO - inhibitory NOS (L-NAME) - aplikace protilátek k isoformám NOS (imunocytochemie, imunoblotting) - exprese genu pro iNOS Bioimaging of Nitric Oxide Using Diaminofluoresceine-2 (DAF-2) DAF-2 DA uf\r-A coo non-fluorescent, cell-permeable non-fluorescent UAr-z coo fluorescent, Ex 495 nm, Em 515 nm Advantages: Sensitivity for NO (5 nM in vitro) with high temporal and spatial resolution. No cross-reactivity to N027NOs- and O N 00 Kojima et a/., BioLPharm. Bull. (1997) Assay limitations: Possible interference by reducing agents and divalent cations, requires standardized illumination conditions Duo* 18 Now records data directly from NOMK11, EVOMX, JS02, pH electrodes and ton Selective Eiectrodesi [SO-NO Nitric Oxide Meter \caiAc not Included Micromanipulator M3301 i — ■■ NOChambe Magnetic Holding Device MIO Steel Base Sensing Element WPI Membrane I __ 100 nm t < c u yw0.596SM + G.49&7 R- - 0.9973 300 600 900 1200 Concentration / nM t 4nM 2nM í SnIVI Time / S Schéma experimentu: 1. RAW 264.7 vysadíme na kultivačnú misku a kultivujeme v DMEM médiu v inkubátore pri 5% C02 a 37°C. 2. Počet buniek stanovujeme pomocou Coulter Countru (Coulter®, Coulter Electronics LTD, England) 3. Bunky o koncentrácii 1x106/800 ul inkubujeme 60 min. v800ul MEM média. 4. Následne do skúmaviek s adherovanými bunkami aplikujeme lipopolysacharid (LPS) -5ng/ml. 5. Mikroskúmavku umiestnime do meracej komôrky a snažíme sa umiestniť elektródu na dno, tesne až k povrchu buniek. 6. Zapojíme elektródu a spustíme meranie. 7. Po ukončení pokusu a odpojení elektródy odpipetujeme médium. 8. V médiu následne pomocou Griessovej metódy spektrofotometricky stanovujeme koncentráciu nitritov (N02-), ktoré sú jedným z koncových metabolitov NO. A - referenčná elektróda B - pracovná elektróda C - pomocná elektróda ABC l RAW 264.7 (1x106) DMEM + 10% FBS (5% C02, 37°C). MEM (NaHC03, stále pH) Hrbac J, Gregor C, Machova M, Králova J, Bystron T, Ciz M, Lojek A. (2007) Nitric oxide sensor based on carbon fiber covered with nickel porphyrin layer deposited using optimized electropolymenzation procedure. Bioelectrochemistry. Sep 27; [Epub ahead of print] GOO Time.'s Fig. 2. Carbon fiber sensor's performance at nanomolar NO concentrations (CPA at R30 mV (vs. Ag/AgCl)). Eight additions of NO into aerated PDS, each resulting in 4 nM NO concentration, followed by response for 20 nM NO are shown. After pretreatment the electrode was coated with poly-NiTMIIPP, electropoLymerLzed fiom 0.4 mM KiTMlTPP by 100 cycles from 0 to 1200 mV (ví. Ag/AgCl}, scan rate IOOmV/s}. NO elektroda ■14.2.2007 RAV\C64.7 + LPS 5ng/rrl 28.2.2007 RAV\C64.7 bez LPS < 1600 Q. 1400 - 1200 - 1000 - 800 - 600 - 400 - 200 - 0 - 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 90000 100000 čas (sek) FARMAKOLOGIE NO Donory NO (nitroglycerin, nitroprusid, NOáty) Inhibitory NOS (L-NMMA, L-NAME, aminoguadinin, asymetrický dimethylarginin) Aktivátory eNOS (endotel-dependentni vazodilatancia) Inhibitory fosfodiesterázy (Zaprinast, Viagra [sildenafil],...)