HPLC Vysokoúčinná kapalinová chromatografie Lízalová Martina LPVR - BFÚ, v.v.i. 26. 11. 2009 Chromatografie q jedna z nejvýznamnějších moderních separačních analytických metod q objevil ji botanik Cvet (v roce 1903 zveřejněna práce o separaci listových barviv na sloupci sorbentu) q prudký rozvoj chromatografie nastal v 60. letech q je separační metoda založena: Ø na různé distribuci jednotlivých složek mezi 2 fáze – mobilní (pohyblivou) a stacionární (nepohyblivou) Ø na rychlosti pohybu jednotlivých složek v téže fázi Rozdělení chromatografických technik Chromatografie q Mobilní fáze: pohyblivá q Stacionární fáze: nepohyblivá Kapalinová chromatografie (Vysokoúčinná kapalinová chromatografie - HPLC) q je založena na kontinuálním opakovaném ustavování rovnovážné distribuce (dělení) složek vzorku mezi dvěma vzájemně nemísitelnými fázemi: Ø Stacionární fáze – nepohyblivá (sorbent) Ø Mobilní fáze – pohyblivá (kapalina) q Separované složky vzorku jsou vnášeny na začátek kolony do proudu mobilní fáze a opouštějí ji v pořadí, v jakém jsou v koloně zadržovány. Nejméně zadržované složky opouštějí kolonu jako první, nejvíce zadržované jako poslední. Mírou zadržení (retence) složky v chromatografické koloně je její retenční čas t[R]. q Rozdělené složky dále vstupují do detektoru, který poskytuje kvantifikovatelnou odezvu na konkrétní (charakteristickou) vlastnost separovaných složek – jako např.: Ø absorpce záření určité vlnové délky Ø vodivost Ø index lomu apod. Kapalinová chromatografie (Vysokoúčinná kapalinová chromatografie - HPLC) q Mobilní fáze: vícesložková (ACN, H[2]O) q Izokratická eluce: ü složení mobilní fáze je po celou dobu analýzy konstantní q Gradientová eluce: ü složení mobilní fáze se mění s časem ü vznik koncentračního gradientu mobilní fáze => pozitiva: ü zlepšuje rozdělení složitějších směsí ü krátí čas analýzy ü zvyšuje citlivost Kapalinová chromatografie Základní aplikace metody HPLC ü separace, identifikace a stanovení látek ve směsích q Stanovení:: organických kyselin, polyaromatických uhlovodíků, bílkovin, sacharidů, vitamínů, léčiv a různých metabolitů ü kvantitativní analýza látek ve směsi ü kontrola čistoty preparátů ü čistění a mikropreparace látek ü kontrola surovin, výrobních meziproduktů a produktů ü kontrola životního prostředí (pesticidy v ekosystémech, potravinách, krmivech) ü klinická a toxikologická analýza (hormony, léčiva, metabolity v tělních tekutinách) ü kontrola potravinářských produktů ü biologické a biochemické aplikace (analýza bílkovin a nukleových kyselin) ü zemědělské aplikace (sledování migrace herbicidů v půdě) Kapalinový chromatograf (Agilent Technologies 1100) Kapalinový chromatograf (Agilent Technologies 1100) q Detektor DAD (Diode – Array) : Ø spektrofotometrický UV-VIS detektor – měří se absorbance; kontinuálně sleduje celé spektrum UV-VIS v rozmezí vlnových délek: 190 – 950 nm (deuteriová lampa) a umožňuje tvorbu 3D chromatogramů Náplň naší práce – stanovení MDA a 4-HNE na HPLC Přehled stanovovaných látek a vstupujících reaktantů q 2 – TBA: Podmínky separace MDA na HPLC ü izokratická eluce ü složení mobilní fáze: ACN : H[2]O (40% : 60%) o voda okyselena => 0,2% vodný roztok CH[3]COOH ü průtok mobilní fáze: 1 ml/min ü dávkovaný objem: 100 μl vzorku ü detekce: 310 nm (absorpční maximum MDA) Náplň naší práce – stanovení MDA a 4-HNE Spektrofotometrické stanovení MDA vs. HPLC Porovnání stanovení MDA reakcí s TBA vs. HPLC SPE – Solide Phase Extraction q extrakce na tuhou fázi = technika přípravy vzorku => neustále roste její význam! q principem je sorbce stanovovaného analytu na tuhou fázi (příslušný sorbent v kolonce) z fáze kapalné (organická rozpouštědla např. MeOH, ACN…) q její přednosti a použití: ü zakoncentrování vzorku ü odstranění nežádoucích látek => přečištění vzorku ü izolace stanovovaného analytu ze vzorku ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) ü někdy také označovaná jako EIA (Enzyme Immunoassay) ü je jednou z nejpoužívanějších imunologických metod sloužících k detekci protilátek ü metoda funguje na bázi imunoenzymatické reakce a lze s ní rovněž detekovat i antigen ü ELISA využívá dvou základních vlastností imunoglobulinů: o schopnost proteinů (tedy imunoglobulinů) vázat se na povrch umělých hmot (např. polystyrenu) o schopnost vázat enzymy na Fc fragmenty (viz. protilátka) imunoglobulinových molekul v Protilátka (imunoglobulin) je protein, který je schopen jako součást imunitního systému identifikovat a zneškodnit cizí objekty (bakterie a viry) v těle. Protilátky jsou nositeli humorální imunity. ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) ü Pro průkaz specifických protilátek i antigenů existuje široké spektrum různých modifikací ELISA testu: o Přímá ELISA - pro detekci antigenu o Nepřímá ELISA - pro detekci specifických protilátek o Přímá sendvičová ELISA - pro detekci antigenu o Nepřímá sendvičová ELISA - pro detekci specifických protilátek Základní složky ELISA testu 1. Antigen: o detekovaný v testovaném vzorku o známý, komerčně připravovaný 2. Protilátka: o detekovaná v testovaném séru o známá, komerčně připravovaná 3. Konjugát: o jedná se opět o protilátku proti protilátce (konkrétně proti druhově specifickým imunoglobulinům příslušného izotypu (proti IgG, IgM, IgA, viz protilátka), na kterou je navázaný enzym (konjugovaná enzymem) 4. Substrát: o je chemická látka, která reaguje s enzymem a tím změní svou barvu Praktické použití ELISA testu Děkuji za pozornost.