REAKTIVNÍ FORMY KYSLÍKU A DUSÍKU A METODY JEJICH STANOVENÍ REAKTIVNÍ FORMY KYSLÍKU A DUSÍKU FCE: l přeměny a uvolňování energie l enzymatické komplexy l signalizační molekuly l mikrobicidní látky ZABÍJEČSKÉ MECHANISMY FAGOCYTŮ ZDROJE VOLNÝCH RADIKÁLŮ ENDOGENNÍ l Enzymatické systémy l NADPH oxidáza l NOS l Peroxidázy l Cytochrom P450 l Xantin oxidoreduktáza l Autooxidační rce. l Proteiny obsahující hem l Elektronový transportní řetězec mitochondrií EXOGENNÍ l Složky potravy l Léčiva l UV záření l Ionizující záření l Znečištěné prostředí FAGOCYTÓZA A OXIDATIVNÍ VZPLANUTÍ OXIDAČNÍ STRES A POŠKOZENÍ BIOMOLEKUL LIPIDOVÁ PEROXIDACE POUŽÍVANÉ METODY DETEKCE CHEMILUMINISCENČNÍ DETEKCE METABOLICKÉ AKTIVITY FAGOCYTŮ l přeměna chemické energie na světelnou (fotony): luminofor + energie → luminofor* → luminofor + světlo l luminofory: l luminol l izoluminol l lucigenin l pholasin l aktivátory: l OZP l PMA l fMLP l CaI l stimulace LPS DALŠÍ LUMINOMETRICKÉ METODY ATP test viability l kvantifikace buněčného ATP » určení počtu živých buněk Stanovení antioxidační kapacity metodou TRAP l zjištění schopnosti test. vzorku vychytávat peroxylový radikál vytvořený generátorem AMPA l standard - trolox STANOVENÍ KONCENTRACE NITRITŮ GRIESSOVOU METODOU l spektrofotometrické stanovení nitritů v médiu l NO » autooxidace » nitrity, nitráty l měření absorbance při 546 nm l výpočet koncentrace nitritů z kalibrační křivky l stimulace LPS ELEKTROCHEMICKÁ DETEKCE OXIDU DUSNATÉHO OXID DUSNATÝ l radikál (lichý počet valenčních elektronů) l jedna z nejstudovanějších molekul posledních let NC (1998): Furchgott, Ignarro, Murad: za klíčové objevy týkající se úlohy NO v kardiovaskulárním systému l syntázy oxidu dusnatého: l neuronální (nNOS = NOS1) l inducibilní (iNOS = NOS2) l epiteliální (eNOS = NOS3) FYZIOLOGICKÝ VÝZNAM NO l komunikace mezi neurony v mozku l relaxace cév l endothelium-derived relaxing factor (EDRF) l (atheroskleróza – nitroglycerin) l mikrobicidní a zánětlivý mediátor l produkce RNS METODY STANOVENÍ NO A JEHO METABOLITŮ NEPŘÍMÉ: Chemiluminiscence Griessova metoda Fluorimetrické metody - stanovení sekundárních metabolitů (nitrity, nitráty) - selektivita a citlivost - časová náročnost - drahé reagencie PŘÍMÉ: Elektrochemické metody + přímé stanovení NO + selektivita a citlivost + minimální spotřeba reagencií + jednoduchá kalibrace + nízká pořizovací cena + stanovení in vivo NO ELEKTRODA l oxidace NO na povrchu elektrody za vzniku potenciálu (jednoelektronový transfer z NO na elektrodu za vzniku NO^+) l povrch elektrody uzpůsoben k vysoké selektivitě a citlivosti k NO l polymery metaloporphyrinu a metalophthalocyaninu l NO reaguje s centrálním atomem kovu skrze N atom ››› oxidace DĚKUJI ZA POZORNOST