Western blotting







                                       Polymerace akrylamidu

•              Smísením roztoku monomeru a dimeru (bis-akrylamidu). Pozor jde o látky škodlivé
zdraví. Akrylamid je karcinogenní a neurotoxický s kumulativním účinkem.



•              Radikálová polymerace

•

•              iniciátorem je persíran amonný (peroxodisulfát (NH4)2S2O8), katalyzátorem je N,
N,N´,N´-tetramethylendiamin (TEMED). Tyto látky lze ve funkci nahradit riboflavinem za přítomnosti
světla a malého množství kyslíku. Inhibitory polymerace jsou kyslík (O2) v nadbytku, látky s SH-
skupinami.



•              Koncentrace monomeru ovlivňuje délku řetězců, obsah dimeru stupeň zesíťování.



                                  Polyakrylamidový gel - příprava

                                          Provedení PAGE

•             Nejčastěji se PAGE provádí ve vertikálním uspořádání, i když běžně i v horizontálním
(použití tzv.“precast“ gelů).



•             Podle tvaru rozlišujeme trubičkové gely („tube gels“) a deskové gely („slab gels“).
Trubičkové gely se připravují ve skleněných trubičkách, slab gely se nalévají mezi plochá skla
oddělená vymezovači tzv. spacery, tím se volí tloušťka gelu. Jamky pro vzorky se tvoří hřebínkem
(„comb“).



•             Trubičové jsou obvykle v rozměrech 0.3-0.5 x 15 cm, deskové gely od minigelů (4 x 5
cm) po sekvenační gely (20-30 x 50-100 cm s tloušťkou mezi 0.05 a 1.5 mm).



                                    Aparatury pro deskové gely



                                             SDS-PAGE

•              Pohyblivost proteinů v gelu při nativní elektroforéze ovlivněna

      - tvarem (globulární, vláknité)

      - hustotou náboje

      - velikostí

•             SDS-PAGE – denaturační varianta

     - proteiny se před nanesením na gel denaturují detergentem SDS

       (laurylsíran sodný)

     - disulfidové vazby se eliminují redukčním činidlem β-mercaptoethanol

     - denaturace je dokončena krátkým varem

     - SDS - obklopí protein – záporný náboj – odpuzování – natažení

                  molekuly

                - počet molekul SDS navázaných na protein je zhruba úměrný

                  jeho molekulové hmotnosti – každý protein má za přítomnosti

                 SDS ekvivalentní hustotu náboje

      - jediným faktorem, který ovlivňuje pohyblivost proteinů v gelu při

       SDS PAGE je molekulová hmotnost



                                           Imunodetekce

•             detekce proteinů pomocí specifické protilátky

•             před vlastní imunodetekcí je membrána blokována

     - zabránění nespecifickým interakcím mezi membránou a protilátkou

     - redukce pozadí

     - roztok hovězího sérového albuminu (BSA) nebo ředěné odtučněné

       mléko (unfatty dry milk)



Primární protilátky

-              monoklonální - protilátky produkované jen jedním určitým klonem B-

                               lymfocytů

                            - specifické pro jeden jediný epitop

                            - produkce – hybridomy (fúze maligních myelomových

                              buněk a zdravých lymfocytů produkujích Ab)

-              polyklonální - produkované po opakované imunizaci zvířete, jeho

                            krev využita jako zdroj protilátek

                          - imunoglobuliny jsou produkty různých klonů B-lymfocytů







                                            Literatura