moderní metody biologického výzkumu (Speciální cvičení) Oddělení cytokinetiky Oddělení patofyziologie volných radikálů Oddělení molekulární cytologie a cytometrie Biofyzikální ústav AV ČR TKÁŇOVÉ (BUNĚČNÉ) KULTURY IN VITRO živočišné, rostlinné, hmyzí, rybí atd. Živočišné buněčné kultury (získané z různých tkání např. hlodavců jako je myš, krysa, křeček nebo opic, člověka) PRIMÁRNÍ KULTURY - buňky získané přímo z živočišných tkání, kousek tkáně, nutná disociace (rozvolnění) buněk a odstranění nežádoucích částí, omezená doba kultivace, specifické požadavky BUNĚČNÉ LINIE - adaptované na dlouhodobý růst in vitro diploidní - karyotyp identický s živočišným druhem, z něhož byly izolovány většinou omezený počet pasáží, stárnou a hynou (omezený tzv. "life-span") heteroploidní - karyotyp a často i morfologie odlišné, dlouhodobá kultivace Udržují se tzv. pasážováním - určitý počet buněk se po určité době přenese do čerstvého živného prostředí ADHERENTNÍ kultury - rostou přichyceny k pevnému podkladu (kultivační nádobky, mikronosiče) SUSPENZNÍ kultury - nevyžadují podklad, rostou volně v médiu Hlavní komerční dodavatelé buněčných linií The American Type Culture Collection (ATCC) http://www.atcc.com/ The European Collection of Cell Cultures (ECACC) http://www.ecacc.org.uk/ lACC Cell Lines (A27SO human ? ovary ibology: epithelial ■thods: Split sub-confluent cultures (70-80%) 1:3 to 1:6 i.e. seeding 3-6 x 104 cells/cm2 using 0.25% trypsin or trypsin/EDTA; 5% C02l 37 °C. jm: RPMI 1640 + 2 mM l-Glutamine + 10% Fetal Bovine Serum (FBS). Not specified The A2780 human ovarian cancer cell line was established from limor tissue from an untreated patient. Cells grow as a monolayer and in suspension in spinner cultures. A2780 is the parent line to the cisplatin resistant cell Ire A2780 cis (ECACC catalog no. 931 12517) and the adriamycin resistant cell lie A2780 ADR (ECACC catalog no. 93112520). Bpped on dry ice___ A2780cis ?s; human ovary ohoiogy: epithelial jbcuiture Method:;. Split sub-confluent cultures (70-80%) 1:5 to 1:20 i.e. seeding 1 x 103to 1 x 10" cells/cm2 using 0.25% trypsin or trypsin/EDTA; 5% C02; 37 °C. ells will attach slowly after resuscitation and take up to 7 days to reach conflu-lency. Recommendation: resuscitate cells in media without cisplatin. Add after subculture of attached cells. We RPMI 1640 + 2 mM L-Glutamine + 1 urn cisplatinum + 10% Fetal Bovine Serum (FBS) (cisplatinum only necessary every 2-3 passages). Modal no. 46 ription. This cisplatin-resistant cell line has been developed by chronic exposure of the parent cisplatin-sensitive A2780 cell line (ECACC catalog no. 931 125 1 9) to increasing concentrations of cisplatin. A2780cis is cross-resistant to melphalan, adriamycin and irradiation. An increased ability to repair DNA damage as well as cytogenetic abnormalities has been observed. In order to retain resistance cisplatinum has to be added to the media every 2-3 passages. In addition to this matched pair of drug-sensitive/resistant cell lines an adri-amycin-resistant cell line, A2780adr (ECACC catalog no. 931 12520), has been isolated from the same parental line A2780. Shipped on dry ice 93112519 1 vial 93112517 1 vial A431 ; ■ human >e: skin phology: epithelial Subculture Methods: Split sub-confluent cultures (70-80%) 1:3 to 1:6 i.e. seeding at 2-4 x 10' cells/cm2 using 0.25% trypsin or trypsin/EDTA; 5% CO;, 37 °C. Medium EMEM (EBSS) + 2 mM L-Glutamine + 1 % Non Essential Amino Acids (NEAA) + 10% Fetal Bovine Serum (FBS). /pe: Hypertriploid 'tion: Derived from an 85 year old female with epidermal carcinoma. The cells carry large numbers of EGF binding sites and is an indicator cell for anti-TGF binding. Shipped on dry ice 85090402 1 via kultivace buněk Speciální plastikové lahvičky, misky různé velikosti - sterilní Kultivace v živném médiu podle růstových a metabolických požadavků buněk v termostatu s řízenou atmosférou - 370 C, 95% vlhkost, 5% CO2. Nutná přísná sterilita!!!! - sterilní roztoky, plastik. nádobky, sklo, pipety atd., sterilizace autoklávem (120 0C), nebo horkým vzduchem (180 0C) Práce ve sterilním laminárním boxu (typ BioHazard - laminární proudění vzduchu, filtry -chrání i uživatele - práce s nebezpečnými viry apod.) Základní médium je balancované chemické prostředí - zdroj pro energii a biosyntézu. Doplňky: a) nedefinované složky - zvířecí séra (hovězí, telecí, fetální, koňské) b) definované složky (růstové faktory, hormony atd.) - specializované podle typu buněk Živočišná séra nejdražší součást média - ze zvířat z ekologicky málo poškozených oblastí vhodné definované náhrady sér Antibiotika a antimykotika penicilin + streptomycin, gentamicin (i proti mykoplazmatům) Suspenzní buňky - po spočítání buněk se část supenze doplní čerstvým kultivačním médiem Adherentní (přisedlé) buňky - uvolnění od podkladu a rozvolnění shluků enzymy např. trypsinem, spočítání buněk, vysetí do čerstvého média. Některé buňky vyžadují tzv. feeder layer - vrstvu buněk inaktivovaných zářením nebo chemicky sloužící jako podklad pro růst specifických typů buněk Kultivace ve sterilních plastikových lahvičkách se šroubovacími uzávěry nebo v miskách různé velikosti. Velkokapacitní kultivace - na mikročásticích ve velkých kontejnerech -automatická výměna média Uchovávání buněk v hlubokozmrazeném stavu (-180 0C - mraznice, tekutý dusík) ve speciálních ampulích a kontejnerech několik let. Nutné kryoprotektivum (proti tvorbě krystalů vody) - většinou dimetylsulfoxid nebo glycerol. Zmrazování je pomalé (řízené po 1 0C), rozmrazování rychlé -ponoření ampulí do lázně 37 0C. VYUŽITÍ BUNĚČNÝCH KULTUR Buněčné kultury se staly nástrojem pro detekci a objasňování mechanismů účinků buněčných regulátorů a genů, které určují individuální aspekty chování buněk. Tato technologie umožnila pokrok ve virologii, somatické buněčné genetice, endokrinologii, toxikologii, farmakologii, hematologii, imunologii i ve výzkumu karcinogeneze a stala se významným nástrojem vývojové biologie, komplexní tkáňové fyziologie a průmyslové výroby specifických buněčných produktů. Výhody: lze sledovat účinky různých faktorů a mechanismy studovaných dějů bez nežádoucí interakce s buňkami jiných typů nebo tkání, účinku humorálních faktorů i celkového stavu organismu lze získat rozsáhlé populace buněk shodných vlastností a sledovat jejich reakce v kontrolovatelných podmínkách homogenita, reprodukovatelnost a množství materiálu umožňuje studovat a odhalovat základní mechanismy vybraných aspektů chování těchto buněk specifické buněčné kultury lze využít k produkci a získávání množství důležitých biologických látek (enzymy, hormony) - hybridomy etické hledisko - systém omezuje využívání laboratorních zvířat Nevýhody: umělý zjednodušený systém poznatky nelze beze zbytku aplikovat na podmínky in vivo Buňky nezralé (nediferencované nebo částečně diferencované) ► buňky kmenové (toti- nebo pluripotentní) ► buňky progenitorové Jsou schopny sebeobnovy, mohou se dále dělit a diferencovat do zralejších stádií. Charakteristické pro embryonální stadium a v dospělém organismu pro některé tkáně (krevní tkáň, střevní a kožní epitel, zárodečné buňky). Schopné kultivace a dozrávání in vitro ve specifických podmínkách. Buňky zralé - diferencované Rozrůzněné podle typu tkáně se specifickými vlastnostmi. Nejsou schopny se dále dělit, stárnou a umírají apoptózou (nervové, jaterní buňky apod.) Schopné kultivace in vitro omezený počet pasáží (diploidní stav) nebo se z nich vytvářejí heteroploidní permanentní linie. Buněčné populace in vitro Imortalizované nádorové linie asynchronní - buňky se nacházejí v různých fázích buněčného cyklu - přirozený stav synchronní - buňky jsou ve stejné fázi buněčného cyklu - uměle navozené různými chemickými látkami, homogenní populace, stejné reakce Využití: při výzkumu dějů vázaných na určitou fázi buněčného cyklu v praxi v nádorové terapii (léčba cytostatiky) KREVNÍ BUŇKY primární - z krve nebo kostní dřeně člověka a laboratorních zvířat detekce jednotlivých typů a počtů na hemocytometru kultivace progenitorů in vitro - BFU-E, CFU-S, GM-CFU - vyžadují specifické podmínky a specifické růstové faktory (erytropetin, GM-CSF, IL-3 apod.) Využití při transplantacích - namnožení buněk permanentní línie - z krve leukemických pacientů nebo lab. zvířat HL-60 - lidská promyelocytární leukémie - promyelocyty schopné diferencovat in vitro - bipotentní, deficientní v p53 kys. retinová (RA), DMSO - diferenciace do granulocytů vit. D3., forbol ester (TPA), butyrát - diferenciace do monocytů-makrofágů Vhodný model pro ► studium regulace proliferace, diferenciace a apoptózy myeloidních buněk ► studium příčin leukemických poruch ► studium účinků kyseliny arachidonové (AA), eikosanoidů a cytokinů (TGF-^ tnfH Při diferenciaci se mění morfologie buněk (mikroskopická detekce na preparátech z cytocentrifugy) stoupá aktivita specifických enzymů (např.nespecifické esterázy) stoupá exprese specif. povrchových antigenů (CD11b, CD 14) - FCM vzniká schopnost fagocytózy a produkce kyslíkových radikálů (měření redukce NBT nebo chemiluminiscenčně) U937 - promonocytární leukémie - promonocyty schopné diferencovat do monocytů po RA, DMSO, TPA, mutovaný p53 ML 1 - lidská myeloidní leukémie - normální (wild type) p53 EPITELIÁLNÍ BUŇKY z adenokarcinomu kolonu - línie HT29, CaCO2, HCT115 - nádorové buňky , ► FHC - fetální střevo - nenádorové. Schopnost diferencovat in vitro po působení butyrátu sodného (NaBt): ► růst aktivity alkalické fosfatázy ► morfologické změny doprovázené polymerizací F-aktinu ► výšení exprese adhezívních molekul - E-kadherinu Vhodný model ► pro studium regulace prolif., dif. a apoptózy epitelu střeva a mechanismů vzniku nádorů kolonu ► pro studium účinků nenasyc. MK a cytokinů Pro ekotoxikologické studie jsou vhodné ► buňky z kůže - keratinocyty - línie HaCaT - normální buňky s aktivním metabolismem AA a citlivé k působení cytokinů ► jaterní buňky: primární hepatocyty (krysí), línie nádorových buněk hepatomu (lidského nebo hlodavců), krysí jaterní fibroblasty ► geneticky modifikované buněčné línie: pro detekci dioxinové aktivity (H4IIELuc) pro detekci estrogenní aktivity (MCF-7, MVLN) studovaných látek Vnesený gen s luciferázou - intenzita odráží aktivaci příslušných vnitrobuněčných receptorů (AhR nebo ER) a je detekována na luminometru VYBAVENÍ LABORATOŘE PRO KULTIVACE BUNĚK ► Sterilní prostředí - speciální plastik, sklo, pipety (skleněné, automatické -různé objemy autokláv, horkovzdušná sterilizace (130 oC) ► Klimatizace, UV světlo ► Destilační přístroj na superčistou vodu ► Laminární box (Biohazard) - laminární proudění vzduchu, filtry - sterilní prostředí pro práci, ochrana při práci ► Inkubátor - 37 oC, 5% CO2, 95% vlhkost ► Počítač částic (buněk) ► Inverzní mikroskop ► Centrifugy ► ELISA reader ► Cytocentrifuga ► Fluorescenční mikroskop ► Vysokoobrátková chlazená centrifuga (výměnné rotory) ► Průtokový cytometr (FACSCalibur, Beckton Dickinson) lasery, 4 fluorescence, sortovací modul stanovení několika parametrů současně u rozsáhlých buněčných populací ► Fluostar - multifunkční přístroj - spektrofotometr, fluorimetr, chemiluminometr ► Zařízení pro molekulární biologii ► Výkonná výpočetní technika MÉDIA Řada druhů podle typu buněk (Eaglovo, Dulbecco, RPMI-1640), dodávají se kompletní tekutá, koncentráty, prášková - skladování 40 C. Nutná kvalitní apyrogenní voda o vodivosti 0,2-0-1 B a chemikálie nejvyšší čistoty. Nutná sterilizace přes filtr 0,21 |i. Základní složky: Glukóza (nebo galaktóza) a glutamin - zdroj energie a uhlíku Aminokyseliny - zdroj energie a dusíku Vitamíny - kofaktory pro enzymatické reakce Lipidy - esenciální mastné kyseliny, cholesterol, etanolamin apod. Anorganické soli - zajišťují osmolalitu, tlumí aciditu, nutriční faktor Pufrační solné směsi - Earlův roztok (fyziolog. roztok s vysokým obsahem NaHCO3) - kultivace v řízené atmosféře s regulovaným obsahem 5% CO2 zabraňuje rozpadu a alkalizaci média. Požadované pH většinou 7,2 - 7,4 - úprava HCl a NaOH Otevřený systém - Petriho misky nebo lahvičky s povoleným uzávěren Optická kontrola - indikátor fenolová červeň Organické pufrační systémy - HEPES 20mM tell Culture Media Classic Media: Media Formulations RPMI-1640 Medium R0883 R 1145 R 1383 R6504 R8758 ornponent [1x] g/L [10x] g/L g/L g/L [1x] g/L ■INORGANIC SALTS Ralcium Nitrate • 4H;0 Magnesium Sulfate (anhydrous) 0.04884 1.0 0.04884 0.1 0.04884 0.1 0.04884 0.1 0.04884 Potassium Chloride 0.4 4.0 04 0.4 « 0.4 Sodium Bicarbonate 2.0 — 6.0 — 2.0 Sodium Chloride 6.0 60.0 68 6.0 6.0 Sodium Phosphate Dibasic (anhydrous) 0.8 8.0 0.8 0.8 0.8 ■amino ACIDS L-Arginine 0.2 2.0 0.2 0.2 0.2 L-Asparagine (anhydrous) 0.05 0.5 0.05 0.05 0.05 L-Aspartic Acid 0.02 0.2 0.02 "MM 0.02 0.02 [[-Cystine • 2HCI 0.0652 0.652 0.2 0.0652 0.02 "H 0.3 0.0652 0.02 0.3 0.0652 0.02 0.3 L-Glutamic Acid ' L-Glutamine 0.02 Glycine 0.01 0.1 0.01 "331 0.01 0.01 ■L-Histidine 0.015 0.015 0.015 0.015 Hydroxy-l-Proline 0.02 0.2 o.o2 .3M 0.02 0.02 L-lsoleucine 0.05 0.5 0.05 0.05 0.05 L-Leucine 0.05 0.5 0.05 0.05 0.05 L-Lysine »HCl 0.04 0.4 0.04 0.04 0.04 L-Methionine 0.015 0.15 0.015 0.015 0.015 [-Phenylalanine 0.015 0.15 0.015 0.015 0.015 L-Proline 0.02 0.2 0.02 0.02 0.02 L-Serine 0.03 0.3 003 0.03 0.03 L-Threonine 0.02 0.2 0.02 0.02 0.02 L-Tryptophan L-Tyrosine • 2Na • 2H20 L-Valine 0.005 0.02883 0.02 0.05 0.2883 0.2 0.005 0.02883 002 0.005 0.02883 0.02 0.005 0.02883 0.02 VITAMINS D-Biotin 0.0002 0.002 0.0002 0.0002 0.0002 Choline Chloride 0.003 0.003 0003 0.003 0.003 ■C Acid 0.001 — 0.001 0.001 0.001 myo-lnositol 0.035 0.35 0.035 0.035 0.035 Niacinamide 0.001 0.01 0.001 0.001 0.001 p-Amino Benzoic Acid 0.001 0.01 0.001 0.001 0.001 D-Pantothenic Acid (hemicalcium) 0.00025 0.0025 0.00025 0.00025 0.00025 Pyridoxine • HCl 0.001 0.01 0.001 0.001 0.001 Riboflavin 0.0002 0.002 0.0002 0.0002 0.0002 Thiamine • HCl Vitamin B12 OTHER 0.001 0.000005 0.00005 0.001 0.000005 0.001 0.000005 0.001 0.000005 D-Glucose 2.0 20.0 — 2.0 2.0 Glutathione (reduced) 0.001 0.01 0.001 0.001 0.001 Phenol Red • Na 0.0053 0.053 00053 0.0053 0.0053 ADD L-Glutamine 0.3 0.3 at 1x — — — Sodium Bicarbonate — 2.0 at 1x 2 0 2.0 — Cell Culture Media Classic Media: Media Formulations Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DME) _1 D 5523 D 5546 D 5648 D 5671 D 5796 Component g/L [1x] g/L g/L [ix] g/L [Ix] g/L INORGANIC SALTS ft ICC n 7£C H 7Gc; fl 7fiR Calcium Chloride • 2H20 Ferric Nitrate • 9H20 0.0001 U.ZDD 0.0001 U.ZD3 0.0001 nnQ7£7 U.ZDD 0.0001 n 0Q767 U.ZO.3 0.0001 fl 0Q767 Magnesium Sulfate (anhydrous) Potassium Chloride 0.4 u.uy / o / 0.4 u,uy /d / 0.4 U 'J J 1 u / 0.4 0.4 Sodium Bicarbonate — — 3.7 — 3.7 Sodium Chloride 6.4 6.4 6.4 6.4 Sodium Phosphate Monobasic (anhydrous) — 0.109 0.109 0.109 0.109 AMINO ACIDS L-Arginine • HCl 0.084 0.084 0.084 0.084 0.084 L-Cystine • 2HCI 0.0626 n mi a 0.0626 0.0626 0.0626 0 0.0626 0.584 L-Glutamine Glycine 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 L-Histidtne • HCl • H;0 0.042 0.042 0.042 0.042 0.042 L-lsoleucine 0.105 0.105 0.105 0.105 0.105 L-Leucine 0.105 0.105 0.105 0.105 0.105 L-Lysine • HCl 0.146 0.146 0.146 0.146 0.146 L-Methionine 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 L-Phenylalanine 0.066 0.066 0.066 0.066 0.066 L-Serine 0.042 0.042 0.042 0.042 0.042 L-Threonine 0.095 0.095 0.095 0.095 0.095 L-Tryptophan 0.016 0.016 0.016 0.016 0.016 L-Tyrosine • 2Na • 2H20 0.10379 fi no/ 0.10379 H CiQA 0.10379 n HQA 0.10379 0 094 0.10379 0.094 L-Valine VITAMINS Choline Chloride 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 Folic Acid 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 myo-lnositol 0.0072 0.0072 0.0072 0.0072 0.0072 Niacinamide 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 D-Pantothenic Acid (hemicalcium) 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 Pyridoxal • HCl 0.004 0.004 — 0.004 — Pyridoxine • HCl — — 0.004 — 0.004 Riboflavin 0.0004 0.0004 0.0004 0.0004 0.0004 Thiamine • HCl 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 OTHER D-Glucose 4.5 1.0 1.0 4.5 4.5 Phenol Red • Na 0.0159 0.0159 0.0159 0.0159 0.0159 Pyruvic Acid • Na — 0.11 0.11 — — ADD L-Glutamine — — 0.584 — — Sodium Bicarbonate 3.7 3.7 — 3.7 — Sodium Phosphate 0.109 — — — — nejčastěji používané fetální bovinní sérum Animal Sera Product Testing for Fetal Bovine Sera ■ F 2442 F 0643 F 3885 F 4135 F 3018 F 0392 SOURCE bovine bovine bovine bovine bovine bovine COUNTRY USA USA USA USA USA USA STERILITY / / / / / / PERFORMANCE / / / / / / CLONING ASSAY / / / / / / VIRUS (raw material) / / / / / / MYCOPLASMA / / / / / BACTERIOPHAGE N/A / / N/A N/A ENDOTOXIN (EU/ml) £10 £10 <10 £10 £10 £10 HEMOGLOBIN (mg %) £20 £20 £20 £20 £20 £20 TOTAL PROTEIN (g %) 3.0-4.5 3.0-4.5 3.0-4.5 3.0-4.5 3.0-4.5 3.0-4.5 ELECTROPHORECTIC PATTERN ✓ / / / IgG / N/A N/A N/A N/A N/A HORMONE TESTING Report result N/A Report result Report result N/A N/A pH at RT 6.7-8.0 6.7-8.0 6.7-8.0 6.7-8.0 6.7-8.0 6.7-8.0 OSMOLALITY (mOsm/Kg H20) 260-340 260-340 260-340 260-340 260-340 260-340 CHEMICAL ANALYSIS / N/A / / N/A N/A y — Indicates testing is performed and product meets specification, FACSCalibu růtoková flow) cytometrie edna z hlavních oužívaných netodologií G 5 ciborcitory ytokinetics Institute of Biophysics, Brno Academy of Sciences Czech Republic DETEKCE PROLIFERAČNÍ AKTIVITY BUNĚK Růst buněk počtv buněk (Bůrkerova komůrka, Coulter Counter) v časových intervalech od vvsetí určitého počtu - růstové křivkv spektrofotometrické stanovení celkových proteinů - Amido black doba zdvojení populace (doubling time), generační doba (trvání buněčného cvklu) Metabolický aktivní část populace izotopové metodv - stanovení podílu populace svntetizující DNA - inkorporace 3H-tymidinu do DNA - detekce hladiny radioaktivity autoradiograficky nebo scintilačně -detektor páření spektofotometrické metody - inkorporace bromdeoxyuridinu - detekce pomocí navázáné protilátkv - ELISA reader nebo průtoková cvtometrie (FCM) metoda redukce MTT na formazan - založeno na aktivitě mitochondrií Stanovení mitotického indexu mikroskopické stanovení podílu buněk v mitóze na řezech z tkání či buněčných preparátech Detekce počtu buněk v jednotlivých fázích buněčného cvklu Flow cytometrie - procento buněk v G0/G1, S a G2/M fázi Stanovení délkv fází buněčného cvklu - autoradiografické metodv, BrDU Testy cytotoxicity MTT test Stanovení viabilitv - vitální barvení tiypanovou modří nebo eosinem Detekce apoptózv/nekrózv Morfologicky -světelný mikroskop Fluorescenční mikroskop Flow cytometrie (AnnexinV, TUNEL, subG0/G1 populace) TRYPAN BLUE diagram ii corner square (enlargement) -G- Count cells on top and left touching middle line (0). Do not count cells touching middle line at bottom and right (0). ► Na počátku stojí pracovní hypotéza, kterou ověřujeme ► Důležité jsou časové a koncentrační závislosti (dose-response) ► Studium působení jednotlivých faktorů nebo jejich kombinací (multivariační analýzy) ► Souvislost proliferace, diferenciace a apoptózy na buněčné úrovni ► Po stanovení základních cytokinetických dat studium detailnějších mechanismů účinků na subbuněčné a molekulární úrovni ► Experimenty se opakují nezávisle nejméně 3x (v případě nejasností i vícekrát) a v mnoha případech zahrnují ještě paralelní měření, která upřesňují získanou hodnotu. ► Výsledky jsou vždy statisticky zhodnoceny a je určena významnost rozdílů. ► Výsledky jsou prezentovány formou tabulek, grafů nebo reprezentativních obrázků či fotografií. Příklady výsledků s využitím buněčných linií wciboratoř Ytokinetiky Biofyzikálni ústav IIVČR, BRNO Růstové křivky 16 0 1-■-—-1 0 24 43 72 144 168 Time of treatment [h] Figure 1. Effect of NaBt (5 mM) on growth of HT-29 and FHC cells (starting density x l(f'/ml). The values are means ±SEM of three independent experiments. 24 48 72 96 0 24 48 72 96 HOURS HOURS Figure 3. Growth of HS578T (A) and U937 (B) cells cultivated in the absence (diamonds) or in the presence of 50 /imol/1 PIROX (squares). 25 /miol/l NDGA (circles) or 50 ^mol/1 ESCUL (triangles). The solid lines and solid symbols represent nonirradiated cells. The dashed lines and open symbols represent cells irradiated with 5 Gy. The data are means ± S.E.M. for three independent experiments performed in triplicates. Cancer Detection and Prevention Vol 24 No 4 2000 FIGURE 5. Number of cells and proportion of cells in cell cycle phases as influenced by combined all-frans-retinoic acid (ATRA) and proadifen (PRO) during the experimental 24- to 96-h period. The points represent the means of 3-8 independent experiments supplied with standard errors (error bars). 3000 E 2500 T, 2000 I 1500 J 1000 500 o 0 BM2 Hours 3000 -i E 2500 -t; 2000 _g 1500 I 1000 z 1 500 o 0 BM2vJUN 24 48 Hours 72 3000 -2500 - BM2cJUN 2000 - 1500 - 1000 - 500 -A [ u 0 24 Hours □ EtOH QMK886 E3ETYA □ NDGA HEsc Fig. 4. Jun proteins and lipoxygenase inhibitors slow down proliferation of BM2 cells. The same number of BM2, BM2vJUN and BM2cJUN cells was seeded and treated with zinc chloride (1.5 x 10~4 M). Four hours later, lipoxygenase inhibitors MK886, ETYA, NDGA and esculetin (Esc) (5 (xM) were added to cultivation media for indicated time. Total cell number was determined using cell counter. Columns represent the average values from three to six independent experiments. Error bars indicate standard deviations. Koncentrační závislosti (dose-response) FIGURE 1. Dose-response profiles o! the individual cell parameters based on concentration of all-(rans-retinoic acid (ATRA) and proadifen (PRO) as independent variables. The points represent the means of 3-10 independent experiments supplied with standard errors (error bars). NBT = nitroblue tetrazolium. vi a * o 09 ° o 8. a ^ 100 80 60 -40 -20 - 0 +| ) I I IIIIMI I I lllltl t I IlMIH 0.00 0.01 0.10 1.00 Concentration of ATRA (pM) (Log10 scale) PRO: 0 \iM PRO: 10 ii u 1 p Q. g o P £ s 2: Im c 120 100 - 80 - 60 - 40 - 20 o4i 0.00 i i lim i i i mm .....mi 0.01 0.10 1.00 Concentration of ATRA (^M) ..... (Log10 scale) ........ PRO: 5 nM PRO: 15 uM FIGURE 2. The effect of al!-/rans-retinoic acid (ATRA) and proadifen (PRO) on the studied cell parameters expressed as model predictions (lines) supplied with experimental points representing the means of 3-10 independent experiments. NBT = nitroblue tetrazolium. vyjádření v % kontroly (neovlivněná populace=100%) Figure 1. Effects of various doses of PIROX (squares), NDGA (circles), or ESCUL (triangles) on 3H-thymidine incorporation (% of nontreated control) in HS578T and U937 cells after 24 h (open symbols) or 72 h (solid symbols) cultivation. The data are means ± S.E.M. for 3-4 independent experiments performed in six parallels. 0 25 50 75 100 CONCENTRATION (10-6 mol/l) MK886 ------- ETYA esculetin NDGA t-1-r 0,0 1,0 2,5 5,0 10,0 20,0 40,0 Concentration (|iM) Fig. 1. Esculetin and NDGA negatively regulate growth of BM2 cells. The cells were cultivated in the presence of lipoxygenase inhibitors or ethanol solvent in indicated concentrations for 3 days. Total cell number in each sample was determined using cell counter. The curves represent the average numbers from three independent experiments. Error bars indicate standard deviations. BM2 cells treated with the amount of ethanol solvent corresponding to 40 jjlM concentration of inhibitor were used as a reference sample. 120 100 80 60 W < H 40 (Li & W 20 55 i—i q 3 o — 120 I a ' 100 > S BO -J K « 60 40 20 HS578T ioo 50 ---ESCUL I 1 OGy S3 lGy ■1 5Gy U937 l00 50 0 ---ESCUL 1 --- NDGA ESCUL Figure 4. 3H-thymidine incorporation (7c of nontreated control) in HS578T and U937 cells subjected to different treatment. The nonirradiated cells or cells irradiated with 1 or 5 Gy were cultivated in the presence of 25 fimo\/\ NDGA, 25 pmol/l ESCUL (inserts 3 a, b) or 50 (.imo\/\ ESCUL or without the agents (---) for 72 h. Data are means ± S.E.M. for three independent experiments performed in six parallels. * p < 0.05: ** p < 0.01 significance of the interactive component. % ID 0 a (A a 2 £ 5. o a E e 1200 1000 800 600 400 200 0 number viability 90 80 70 ~ 20 10 0 0 0.5 5 10 15 30 60 -50 E 40 .2 > 30 = concentration of TNF-a (ng/ml) Figure 1. Growth and viability ofHT-29 cells after 120-hour-treatment with TNF-a. P<0.05 versus untreated control; (*) Tukey or (+) LSD test. A2780 A2780cis CO > > 3 w o 120 -i 100 - Cisplatin: IC50= 1.34 pM ICg0 = 6.17pM LA-12: IC50 = 0.22(iM IC90 = 1.00 nM 0.01 0.1 1 10 100 Concentration [liM] 1000 TO > 3 CO u o 120 -i 100 - Cisplatin: IC50 = 24.23 pM ICgo = 48.07 pM LA-12: IC50= 1.40 pM IC90= 2.65 nM 0.01 0.1 1 10 100 Concentration [liM] 1000 Fig. 2. Time- and dose-response effects on the survival of A2780 and A2780cis cancer cell lines. The effects after 72 h exposure to cisplatin or LA-12 in a concentration range between 0.3 jxM and 256 |xM were determined by MTT assay. The calculated drug concentrations inhibiting metabolic activity of cells by 50% (IC5o) and 90% (ICgo) are displayed for both derivatives. The results are expressed as mean ± standard deviations (S.D.) of at least three independent experiments; all concentrations were tested in three replicates. PARAMETRY BUNĚČNÉHO CYKLU A2780 UNTREATED CONTROL C ISPtATlN(50) LA-12(50} GÖ/G1:?t,2±8.9% S: 35.3 ± 6.8% G2/M: 14.0 ±3.0% G0/G1: 45.5 ±6.4% S: 24,5 * 6.3 % í; 24-0 f 67% (' i! S: 29.8 ± 5.4 % G2/M: 21.32 ±15% I" 1 ' 'j! ;4 G0/G1: 71.2 ±6.9% S: 1S.S± 2.2% G2/M:8J2 11.3% G0/Gt:45,5± 84% (*) S; 33.2 ±3.1 %(*) G0/G1;54,11± S: 29.3 ±3.4% (*) i&$*&a$ DNA FLUORESCENCE Figure 2. Representative results of flow cytometric analysis of the cell cycles of U937 and HS578T cell lines after 24 h of cultivation. Cells were treated with 25 /xmol/1 NDGA, 50 ^mol/1 ESCUL, or irradiated with 5 Gy. Esc f I ETYA I G0G1-phase ndga S-phase 90 0 10 20 30 40 50 60 70 80 00 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 |dbm2 dbm2vjun ■bm2cjun j Cell Number (%) Fig. 5. The effects of lipoxygenase inhibitors on cell cycle of BM2 cells expressing v-jun or c-jun. BM2, BM2vJUN and BM2cJUN cells were treated with zinc chloride and lipoxygenase inhibitors (5 liM) or ethanol solvent (EtOH) for 1 day. Harvested cells were fixed and stained with propidium iodide. DNA content in individual cells was determined by flow cytometry. The bars represent the average values from three independent experiments. Error bars indicate standard deviations. I JD M S. 0 1 G0/G1 03 S OG2/M r r 0 0.5 5 10 15 30 concentration of TNF-a (ng/ml) Figure 2, Cell cycle ofHT-29 cells after 96-hour-treatment with TNF-a. (*) P<0.05 versus untreated control for Tukey test. Control ATRA 16 h 48 + 16 h 16 h 48 + 16 h TNF-a 0 ng/ml TNF-a 10 ng/ml TNF-a 0 ng/ml TNF-a 10 ng/ml 4.1 s I-1 lie ' ' m ' M 5.4 % i i,l 1 1 L ,1- 7.3 % I 1 1 1 !""&' im ' S joo an * »" ' so ii» ltd 29» "»o » *> «» '» ™ 250 s.a % 1-1 m im i:o 2I0 An DM 12.2 % | 1 1 1 16 h DMSO 48 + 16 h 96 + 16 h I-1 r1 m 11* s**iiis =4- ft 100 1» 200 JSO PU4 3 44.4 % 1 Fig. 2. Represent alive DNA content analyses (n = 3) for HL-60 cells treated with DMSO or ATRA. and TNF-a. Cells were stained and analyzed as described in Materials and Methods. y-axis, counts; .r-axis. PI staining. Gales denote subdiploid fraction. EXPRESE PROTEINU (WESTERN BLOTTING) Interakce kys. arachidonové (AA) a dokosahexaenové (DHA) s butyrátem Exprese antiapoptického proteinu Mcl-1 FHC Mcl-1= 40/42 kDa ß-actin=40kDa HT-29 Mcl-1 actin HCT116 Mcl-1 actin s i í A2780 A2780cis (a) PARP 24 h 48 h 72 h (b) p53 24 h 48 h 72 h (c) 13 kDa 89 kDa mm M§ — m mm mm |)£ mm mm 113 kDa 89 kDa 113 kDa 89 kDa 53 kDa 53 kDa 53 kDa A2780 A2780cis § s 3 r 9 ^ o > 3 — S a | ■3 3 » 5' 5 ' r 9 > r S — 24h 1 1. i± 0.8* 4.6* 1.4* 1.6* 0.1 2.1* 0.8' 24h i 6.2* 11* 8.2* 1.0* 2.3* 0.2' 2.8* 0.9* 4Sh 1 4. 1* 1.4 6.«* 1.8* 2.6± 0.2 4.8* 1.9* 48h 1 6.8=t 1.9* 6.9* 0.2" 3.2* 0.3* 3.4* 0.6* 72h 1 2.5* (1.6* 3.74 (1.7* 1.6* 0.2 2.3* 0.6* 72h 1 5.6* 2.0* 7.0* 2.8* 3.3* 0.8 3.3* 1.0 (d) B-actin 42 kDa Fig. 8. Western blot analyses of (a) PARP (upper panel) and (b) p53 (middle panel) protein levels in A2780 (left panel) and A2780cis cells (right panel). The cells were not exposed (untreated controls) or exposed to ICsoor 1CW concentrations of cisplatin or LA-12 and harvested at 24 h, 48 h, and 72 h of sustained drug treatment. One representative experiment of at least three is presented. Table (c) contains values of p53 expression quantified by densitometry (mean ± S.D. of at least three independent experiments). The symbols (*) denote significant difference (p < 0.05) from untreated control; (#) denote significant difference (p < 0.05) between equitoxic cisplatin and LA-12 effects. Equal loading is documented by detection of (d) p-actin (botiom panel). laboratory Lsjytokinetics Detekce buněčné diferenciace (a ktivita alkalické fosfatázy, spektrofotometrie) TNF - O ng/ml__TNF - 0,5 ng/ml TNF -15 ng/ml__TNF - 30 ng/ml Doporučená literatura: Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures, Eds. A. Doyle, J. B. Griffiths, D. G. Newell, Wiley&Sons Inc., London 1995 Current Protocols in Cytometry, Ed. J. P. Robinson et al., Wiley&Sons Inc., New York 1997 T. Eckschlager a kol.: Průtoková cytometrie v klinické praxi