ENZYMOVÁ DEGRADACE NUKLEOVÝCH KYSELIN
Zúčastněné enzymy:
1. NUKLEÁZY: hydrolýza polynukleotidových řetězců, (různorodost co do substrátové specificity a specificity účinku)
2. fosforylázy (PNPáza) - při depolymeraci polyribonukleotidů přenášejí odštěpenou část řetězce na anorganický fosfát nejistá biologická role
3. fosfomonoesterázy (odštěpují koncový fosfát) Úloha:
- trávicí enzymy (intra- a extracelulární)
- odbourání RNA (zejm. mRNA)
- sestřih prekurzorových molekul RNA
- reparace DNA
- štěpení cizorodých DNA
KT ASIHKACE NUKLEÁZ
A. PODLE SUBSTRÁTOVÉ SPECIFICITY
1. RIBONUKLEÁZY
štěpí pouze RNA => striktně vyžadují v substátu přítomnost 2'-OH skupiny v cukerném zbytku
:2.DEOXYRIBONUKLEÁZY
štěpí pouze DNA => striktně vyžadují nepřítomnost 2'-OH
skupiny v cukerném zbytku
i."NESPECIFICKÉ" NUKLEÁZY
štěpí oba typy substrátu (jsou obvykle „nespecifické" pouze v tomto smyslu)
B. PODLE ZPŮSOBU ATAKU POLYNUKLEOTIDOVÉHO ŘETĚZCE
1. ENDOLYTICKÉ ENZYMY (ENDONUKLEÁZY)
účinkují kdekoli uvnitř řetězce, produkují oligonukleotidy a způsobují rychlé změny fyzikálních vlastností (délka molekul => viskozita, sedimentace apod.)
obvykle nejsou schopny odštěpovat mononukleotidy => neštěpí dinukleotidy a trinukleotidy
2. EXOLYTICKÉ ENZYMY (EXONUKLEÁZY)
postupně odštrěpují mononukleotidy z konců řetězce změny fyzikálních vlastností polynukleotidů jsou pomalé
i
C. PODLE ZPŮSOBU ŠTĚPENÍ FOSFODIESTEROVÉ VAZBY
5' fosfát, 3' hydroxyl
DNáza 1
fosfodiesteráza 1 -SI Pl
5' CH2 báze
3'
O OH
3; fosfát, 5* hydroxyl
DNáza 2 fosfodiesteráza 2 ribonukleázy A, TI, T2, Ul, U2 MNáza
DALŠÍ KRITÉRIA:
1. sekundární struktura substrátu
(jednořetězcové vs. dvouřetězcové polynukleotidy, otevřené struktury)
- někdy může struktura substrátu ovlivnit způsob ataku enzymem (BAL31, MNáza)
2. směr štěpení u exonukleáz (5'->3\ 3'->5t)
a požadavek na přítomnost koncového fosfátu
(fosfodiesterázy, exonukleáza III)
3. procesívní a distributivní exonukleázy:
procesívní: zůstávají vázány na stejný řetězec, dokud jej celý nerozštěpí (Exo III, RNáza II)
distributivní: oddisociují po odštěpení každého nukleotidu (fosfodiesterázy)
4. preferenční štěpení v sousedství určitého nukleotidu
báze - A, C, G, T/U (ribonukleázy A, TI, T2, Ul, U2) nebývá absolutní - obvykle se liší rychlost reakce
5. absolutní specificita pro určitou sekvenci
restrikční endonukleázy
citlivost k metylaci cílového místa
„NESPECIFICKÉ" ENDONUKLEÁZY
štěpí endolyticky RNA i DNA
Mikrokokální nuklcáza (MNáza) (Staphylococcus)
štěpí RNA a denaturovanou DNA na směs mono- a oligonukelotidů s
3*-koncovým fosfátem
(i ds DNA je pomalu štěpena: nejprve dvouřetězcové zlomy a poté exolyticky)
preferuje A+T bohaté oblasti; vyžaduje Ca2+
Nukleázv selektivní pro jednořetězcové nukl. kvselinv
štěpí s vysokou selektivitou ss DNA a RNA, tvoří 5-fosfátové konce využití - detekce otevřených oblastí v dsDNA
detekce chemicky modifikovaných míst
N. z Neurospora crassa - Ca2+, Mg2+; preference pro G;
při vyšších konc. NaCl zcela specifická pro ss polynukleotidy Nukleáza SI (Aspergillus oryzeae)- kyselé pH optimum (4.5), Zn2+ Nukleáza Pl (Penicillium citrinum)-ntutvéká pH, Zn2+,
štěpí i při vysokých teplotách (70 °C) „Mung bean" nukleáza I - kyselé pH optimum, Zn2+, štěpí při nízké
iontové síle (inhibice solemi)
Nukleáza BAL31 (Alteromonas espejiano)
extrémní tepelná stabilita, štěpí při vysoké iontové síle (7 M CsCl), je aktivní v 5% SDS; vyžaduje Mg2+ nebo Ca2+ jednořetězcové RNA a DNA štěpí endolyticky nativní DNA štěpí exolyticky od obou konců
(zkracuje současně oba řetězce => využití při konstrukci
rekombinantních DNA)
B. NESPECIFICKÉ EXONUKLEÁZY
Fosfodiesteráza I (z hadího jedu)
odštěpuje z RNA a DNA (produktů štěpení DNázou I)
nukleotid 5-fosfáty štěpí ve směru 34->5í, vyžaduje volný 34 koncový hydroxyl
Fosfodiesterázall (ze sleziny)
odštěpuje z RNA a DNA (produktů štěpení DNázou II)
nukleotid 3-fosfáty štěpí ve směru 5ť->3', vyžaduje volný 5' koncový hydroxyl
Exonukleáza III a exonukleázová aktivita DNA polymerázv I z E. coli:- štěpí jeden řetězec duplexní DNA nebo RNA v hybridu s DNA
RIBONUKLEÁZY
- enzymy zúčastněné v procesech odbourání RNA - dobře charkaterizované, využití v laboratoři pro štěpení/odstranění RNA obvykle produkují 3'-koncový fosfát
-enzymy zúčastněné v „procesování" prekurzorových RNA - málo
charakterizované
produkují 5' - koncový fosfát
A. ENDONUKLEÁZY PRODUKUJÍCÍ 3'-KONCOVÝ FOSFÁT vesměs štěpí dvoustupňovým reakčním mechanismem přes cyklický 2% 3< fosfodiester (RNázy A, T, U, L); z toho důvodu štěpem' DNA nepricházi\ úvahu
Hydrolýza cyklického diesteru je enzymem řízena do polohy 3' (stejným mechanismem probíhá i alkalická hydrolýza RNA; při ní však vzniká statistická směs 2' a 34 fosfátů)
vesměs vykazují preferneční štěpení v sousedství určitého nukleotidu
Pankreatická ribonukleáza (RNáza A)
jeden z nejlépe prostudovaných proteinů
syntetizována chemicky (homogenní i hetrogenní syntézou)
jako první uměle vyrobený aktivní enzym
jednoduchý protein, molekulová hmotnost 13 700 široké pH optimum (pH 7 - 8.2) teplotní optimum 65 °C extrémní tepelná stabilita (nelze inaktivovat varem) inaktivuje se alkáliemi
RNázy B. C D: týž enzym různě glykosylovaný na Asp-34 RNáza S: uměle získaná štěpením subtilisinem
(mezi 20. a 21 aminokyselinou)
PREFERENČNĚ štěpí na 34 straně od pyrimidinového nukleotidu
(„za"fosfátem) např.:
5' ApCpCpCj^ApGp 8
specificita není absolutní, Ap- vazby jsou též pomalu štěpeny
Ribonukleáza TI (Aspergillus oryzeae) neutrální pH, tepelná stabilita, Mr 11 085
preferenčně štěpí na 3* straně od guaninového nukleotidu
Ribonukleáza T2 (Aspergillus oryzeae)
preferenčně štěpí na 36 straně od adeninového nukleotidu
např.: |   |  | | TI
5' ApCpCpCpApGpGpGpUpUpUpApGpUpCp3' i * ♦ T2
Ribonukleáza Ul a U 2 (Ustilaso sphaerogená)
U1 preferenčně štěpí na 3' straně od guaninového nukleotidu,
U 2 obecně od purinového nukleotidu
např.: I   I   I | U1
5' ApCpCpCpApGpGpGpUpUpUpApGpUpCp3' f i f I f Mu2
RNáza I (£. co/0
štěpí ssRNA bez zjevné preference (ale polyU je štěpena rychleji než ostatní homopoylribonukleotidy)
RNáza PhvI a PhvII (Physarum polycephalum)
využití při sekvenování RNA (v kombinaci s dalšími ribonukleázami)
Phyl štěpí UpN mnohem rychleji než CpN
PhvII silně preferuje GpN, zatímco ApN a PypN zůstávají neštěpeny
INHIBITORY RIBONUKLEÁZ
využití zejména při ochraně RNA během její izolace
1. komoetitivní inhihice oligonukleotidv
např. ApUp inhibuje RNázu A („špatný", pomalu reagující substrát) 2'-5' GpG RNázu TI (neaktivní izomer substrátu) analogy oligonukelotidů s arabinózou místo ribózy
2. polvaniontv
tvoří komplex s kladně nabitým enzymem (místo substrátu); hegarin, polyvinylsulfát
3. inaktivace SDS. guanidiumizothiokvanátem
inaktivují enzymy tím, že je denaturují zároveň se používají pro lýzi buněk
4. RNasin
proteinový inhibitor, který tvoří s RNázou A latentní komplex před tím, než je sekretována
5. DEPC
běžná inaktivace RNáz v laboratoři X modifikuje nukleové kyseliny!!
POLYNlJKLFOTTn FOSFORYLÁZA
(PNPáza); enzym běžně rozšířený v bakteriích
není to nukleáza - nakatalyzuje hydrolýzu, ale reverzibiiní reakci
nNDP^r (NMP)n + nPi
I      reakce je reverzibiiní, protože energie \        zůstává zachována v pyrofosfátové („makroergické") vazbě
-reakce ve směru polymerace neprobíhá podle žádného templátu,
vzniká statistický polymer
-může prodlužovat oligonukleotidový primer
-při 0 °C štěpí pouze poly(A) => analýza mRNA
enzym z E. coli: tři identické podjednotky, každá okolo 90 000 vyžaduje Mg2+ (lze nahradit Mn2+)
využití: biosyntéza polynukleotidů, radioaktivní značení RNA velký význam při rozluštění genetického kódu
in vivo - ne zcela jasná funkce, zřejmě normálně katalyzuje depolymeraci RNA (při zachování chemiské energie) - odbourání mRNA v kooperaci s RNázou II
DEOXYRIBONUKLEÁZY
A. DNA endonukleázv
dělení na „třídy" I (produkuje 5' fosfáty) a II (3'fosfáty)
(srovn. fosfodiesterázy)
měření aktivity:
a. vysoké aktivity - měření podílu rozpustného v kyselinách (měří se UV absorbance nebo radioaktivita)
vysokomol.        částečně zcela hydrol.
DNA hydrol.
okyselení +centrifugace
supernataqt precipitát
b. malé aktivity - štěpení superhelikální DNA: jediné přerušení řetězce způsobí změnu elektroforetické mobility
jednořetězcový zlom: štěpení 1 řetězce (DNá
dvojřetězcovy zlom: štěpem obou řetětf ů ve stejném místě (DNáza II)
superhelikální DNA
otevřená
kružnicová
DNA
lineární DNA
lin
Pankreatická deoxvribonukleáza I (DNáza I) (trávicí enzym) štěpí DNA až na di- a oligonukleotidy (v průměru tetranukleotidy) s 5-koncovým fosfátem (substráty pro fosfodiesterázu I) Mr=31 000, pH optimum 6.8 - 8.2
má dvě disulfidové vazby, redukcí (merkaptoethanol) se inaktivuje;
k inaktivaci nedojde v přítomnosti Ca2+
vyžaduje Mg2± (4 mM) => inhibice EDTA, citrátem...
vysokomolekulárni nativní DNA je hydrolyzována rychleji než denaturovaná DNA a krátké řetězce => autoretardace v počátečním stadiu - jednořetězcové zlomy
syntetické polynukleotidy: v poly(dG).poly(dC) je dC řetězec
štěpen jen v přítomnosti Ca2+ (vedle Mg2+)
nebo je-li Mg2+ nahrazen Mn2+
inhibitor: monomerní aktin
DNáza II (brzlík, slezina; v lysozomech - intracelulární) Mr 40 000,
pH optimum 4.5 - 5.5, nevyžaduje Mg2+ (inhibuje)
vytváří dvouřetězcové zlomy, tvoří 3'-fosfátové konce konečný produkt - průměrně hexanukleotidy
Mn2+ může Mg2+ nahradit (změna specificity)
preferenčně jsou štěpeny
Endonukleáza IV - AP endonukleáza třídy II; asi 10 % AP aktivity (zbytek endonukleáza VI)
Endonukleáza V - nejlépe štěpí ssDNA na krátké oligonukleotidy, kromě toho též vytváří jednořetězové zlomy v ds DNA poškozené UV zářením (pyrimidinové dimery => distorze) a v dsDNA obsahující uracil místo thyminu; produkuje 5' koncový fosfát
Endonukleáza VI - totožná s exonukleázou III
AP endonukleáza třídy II (a 3'->5' exo... a 3' fosfatáza »)
sama je schopna štěpit AP místo a rozšiřovat „mezeru" při opravě
Endonukleáza uvrABC - vystepuje pyrimidinové dimery
Reštrikční endonukleázy - štěpí dsDNA ve specifických sekvencích »>
Endonukleázy indukované fágv po infekci bakteriální buňky
T4 endonukeláza II - vytváří jednořetězcové zlomy v dsDNA (jiné než T4 DNA) vzdálené asi 1 kbp, 5ť -koncový fosfát
T4 endonukleáza IV - podobný účinek, ale „hustěji a vždy s dCMP koncem
protože T4 DNA obsahuje 5-hmC, nem štěpena
Endodeoxvribonukleázv z E. cnli
(E. coli obsahuje asi 9 DNáz kódovaných chromozomem; často mají význam v procesech reparace)
Endonukleáza I - náhodně štěpí dsDNA na fragmenty asi 400 bp
dlouhé (dvojřetězcové zlomy) denat. DNA štěpí asi 7x pomalej dsRNA ji inhibuje (tvoří v buňce latentní komplex, aktivace RNázou)
Endonukleáza II -jde ve skutečnosti o směs enzymů zúčastněných v procesech odstranění poškozené DNA, včetně N-glykosylázy a AP endonukleáz »)
Endonukleáza III - jednoduchý enzym (Mr 27 000), který vykazuje kombinovanou aktivitu N-glvkosvlázv (odstraňuje poškozené báze) a AP-endonukleázv (štěpí v místě chybějící báze) třídy I
další odbourání - exonukleázy třídy I, II
X    Y Z
X    Y Z
X    Y Z
V
\
■ R.
Bp*
Phosphatase acrion
M -
Exonuclease
act" ion
'OH-
M N
SOH P
M
OH
Fig. 4.8 Sequential action of E.coli exonuclease III (DNA phosphatase-cxonuclease) on a DNA chain terminated by a nucleotide carrying a 3'-phosphate group.
Fig. 4.9  Mechanism of action of stepwise attack of E. coli exonuclease III on native DNA beginning at the 3'-hydroxyl termini.
Exonukleáza IV působí poodbně jako fosfodiesteráza I (nejlépe štěpí DNA předštěpenou DNázou I => „oligonukleotid fosfodiesteráza")
Exonukeláza V (recBC nukleáza) - úloha při reparaci a rekombinaci štěpí exolyticky ds i ss DNA na oligonukleotidy za současné hydrolýzy ATP (ATP dependentní DNáza a naopak); endonukeláza pro ssDNA pro nukleázovou aktivitu vyžaduje Mg2+; bez něj odvíjí dsDNA (vyžaduje ATP, stimulována ssb proteiny)
Exonukleázové aktivity DNA polymerázy I
A. 3'->5' EXQr AKTIVITA (proti směru polymerace) - zachovaná v Klenowově fragmentu (76 000); většina prokaryotických DNA polymeráz (vč. E. coli II a III)
od 3'-OH konce odštěpuje monofosfátv jako exo I (ale štěpí i dinukleotidy); preferuje ds DNA, neštěpí řetězce s 3'-fosfátem ani RNA význam - opravny mechanismus při polymeraci; ihned odstraní omylem zabudovaný „nepasující" nukleotid (při absenci nukleotidtrifosfátů odbourá celý řetězec)
B. 5'~>3' EXO- AKTIVITA (po směru polymerace)
- malý fragment (34 000)
zcela specifická pro ds DNA („na templátu");
bez ohledu na 54 -koncový fosfát odštěpuje z většiny mononukleotidy , 20-25 % jsou di- a delší oligos =>může vyštěpit pyrimidinové dimerv (reparace) je RNázou H (odstraňuje primery při replikaci) „nick translation"
Exonukleázv z E. coli
Exonukleáza I - štěpí pouze ssDNA (ne ds ani RNA) od 3'-OH konce na 54 monofosfáty, až zbyde dinukleotid (ten neštěpí) štěpí i fágovou DNA obsahující glukosylovaný 5-hmC
Exonukleáza II - 3'->5' aktivita DNA polymerázy I »
Exonukleáza III - 3í->5i exonukleáza, 3'-fosfatáza, AP endonukleáza
Fosfatázová aktivita: odštěpí 3' fosfát jako anorganický, ale ne z mono- a oligonukleotidů a z RNA, pouze z ds DNA
Exonukleázová aktivita: v ds DNA odštěpuje monofosfáty od 3' konce, pokud nem fosforylovaný (pokud je, fosfát si odstraní); rovněž ^SĚ štěpí RNA v DNA:RNA hybridu (RNáza H)
AP-endonukleázová aktivita (třída II), = endonukleáza VI - asi 85 % AP aktivity v E. coli
„COMMON SITE MODEL": enzym má tři oblasti: a/ - rozeznává deoxyribózu v „neštěpeném" řetězci b/ - štěpí 3* fosfáty ve druhém řetězci; avšak pouze tehdy, když c/ - nalezne     buď /párovaný deoxyribonukleotid (=> AP aktivita)
(lOOOOx rychleji)
nebo 3' - koncový fosfát (=> fosfatáza)
nebo 3'-OH koncový nukleotid (je na konci tranzientně
nespárovaný - srovn. DNA polymeráza I) (=> exo)
REŠTRIKČNÍ ENDONUKLEÁZY
„story":
při primární infekci bakterie fágem fág špatně roste
avšak: při reinfekci fágem, který „přežil" primární infekci, roste již dobře
proč:
v bakteriích existují endonukleázy vysoce specifické k určité sekvenci (štěpí jen tehdy, pokud ji rozpoznají) - reštrikční endonukleázy vlastní DNA je chráněna modifikací (metylací») cílového místa; modifikované místo restriktáza nepozná a neštěpí -při první infekci fág nemá metylovaná reštrikční místa a je štěpen; avšak některé molekuly fágové DNA jsou „omylem" metylovány („de novo"), ty přežijí a při příští infekci téhož hostitele jsou považovány za vlastní DNA
PRINCIP METYLACE a RESTRIKCE: restriktázy jsou buď samy metylázami (typ I a III) nebo mají své komplemetární metylázy (typ H)
po replikaci je jeden řetězec metylován. druhý ne: taková místa jsou
rozpoznána a „dometylována" místa nemetylovaná v obou řeztězcích jsou rozpoznána a DNA štěpena místa metylovaná v obou řetězcích nejsou rozpoznána
s určitou frekvencí dochází k metylaci „de novo", tj. v místech nemetvlovanvch v obou řetězcích
„vlastní" DNA ■ f
■Mljmi............iiiiiiiiiiMMiiiin
replikace
metylace
,cizí" DNA restrikce •lilU::::::::::::::::::::::::::::::!!!!;. -»»
(metylacejrte novo)
....., .iIIl
'"h
•■■i,,,
► metyl ováný
..........II"1 nemetylovaný
řetězec
Restriktázv tvou I
muHifunkční komplexní proteiny
-nukleázová (vyžaduje ADP, AdoMet a Mg2+), metylázová a ATPázová aktivita
EcoB, EcoK - tři podjednotky, produkty tří genů (hsdR- restrikce, /zsdM-metylace, hsdS - specificita)
1. nejprve naváže AdoMet => allosterická změna na aktivní formu
2. nespecificky interaguje s DNA, migruje podél DNA (lineární difuse) k místu, které specificky rozpozná:
metvlace
AACNNNNNNG1TGCB ^TGNNNNNNi
Eco K
konzervované úseky
Eco B
3. reakce podle stavu rekogničmho místa («);
-metvlace v reakci stimulované ATP v zpola metyl ováném místě; ve
zceůla nemetylováném s frekvencí asi 0.2 % (přeživší fágy)
-reštrikční štěpení - mimo rekogniční místo ve dvou stupních (jeden a po chvíli druhý řetězec „o kus vedle" (posunutý zlom); poté se nukleázová aktivita zruší (při jedné aktivaci štěpí jen jedno místo) a následuje ATPázová reakce - štěpem asi 105 na jednu reštrikční reakci
Restriktázv tvpu II
jednodušší enzymy: dvě stejné podjednotky, vyžadují jen Mg2+, nejsou metylázy (ani ATPázy), ale mají své komplementární metvlázv
(které rozpoznávají a metylují stejnou sekvenci) štěpí v sekvenci, kterou rozpoznávají (nebo blízko, Hgál) reštrikční místa mívají středovou symetrii (stejně tak enzymy) -tupé (Smál, Hindlľ) nebo kohezní (EcoRÍ, BarriRl) konce -místa někdy obsahují nespecifické báze nebo částečně specifické (Pu, Py, A.T pár v jakékoli orientaci...)
-mohou a nemusí být citlivé k metylaci (Hpall vs. Mspl);
Dpnl vyžaduje metylaci cílového místa
Restriktázv tvpu III
-dvě různé podjednotky, nukleázová, metylázová a rekogniční aktivita -nejsou ATPázy
-metylázová a nukleázová aktivita kompetují, aktivní je pouze holoenzym -nesymetrická rekogniční místa; jen jeden řetězec je metylován -štěpí 20 - 30 bp na 3' straně od rozpoznávacího místa
Nomenklatura
systém dle Smith a Nathans
EcoRl
bakterie     kmen     pořadí, ve kterém byl enzym
připraven
Izoschizomerv
rozpoznávají stejnou sekvenci, ale nemusí ve stejném místě štěpit (a mohou být různě citlivé k metylaci)
Interakce restrilctáz typu II $ DNA
- velká podobnost jednotlivých enzymů
- společné reakční schéma:
nespecifická interakce kdekoliv na molekule -> lineární difuse k restrikčnímu místu -> tvorba specifického komplexu spojená s konformačnízměnou proteinu i DNA -> Štěpení DNA
DNA (z „půdorysu")
Nespecifická vazba
-relativně slabá za podmínek optimálních pro štěpení (tj. mM Mg2+)
- silnější v nepřítomnosti hořčíku
- značně závisí na koncentraci solí: to ukazuje na značný elektrostatický příspěvek (tj. iontové interakce s fosfáty)
Eco RV: nejlépe prostudovaná:
-komplex je držen pohromadě pěti kontakty aminokyselin z každé podjednotky s cukrfosfátovou kostrou
-katalytické centrum není v nespecifickém komplexu v aktivní konformaci a ty Části molekuly, které interagují s restrikčním místem, nejsou „správně" uspořádány
- v těchto částech je volně vázáno velké množství molekul vody (~100 na holoenzym) a iontů, které jsou při tvorbě specifického komplexu uvolněny
(interference s vazbou/uvolněním molekul vody, např. osmotický tlak, je zodpovědná za tzv. „hvězdičkovou aktivitu", tj. méně stringentní Štěpení)
-"nasednutí" enzymu na DNA v kterémkoli místě a hledání restrikčního místa podel řetězce (= redukce na jednorozměrný problém) zvyšuje pravděpodobnost a rychlost jeho nalezení např. EcoR / postupuje rychlostí 7x10-* bp/s !!
- enzym ..klouže" podél molekuly DNA a opisuje helikální zkrut; děj je podmíněn citlivou rovnováhou přitažlivých a odpudivých elektrostatických sil
(alternativní mechanismus - „skákání", tj. mikroskopické disociace/ascciace- není pravděpodobný: enzym ,,nepřehlédne" Žádné reštrikční místo a může být zablokován neobvyklou strukturou DNA, např. triplexem; navíc se „odráží" od konců lineární DNA)
- "hvězdičková" místa enzym ..zdrží" až na 20 s (i za optimálních podmínek, kdy nejsou štěpena; enzym „ověřuje", zda není na „své" sekvenci, a poté pokračuje, čas, po který se „zdrží", koreluje s podobností místa ke kanonické sekvenci a tedy s relativní afinitou enzymu k danému místu)
.C
Specifická vazba a rozpoznání restrikčního místa
-nejlépe prostudován je enzym EcoRV (GATATC)
- ve specifickém komplexu je DNA ohnuta o 55°, čímž je místo „odvinuto", u cetrálních bp porušena stacking interakce
- komplex je těsný, enzym těsně „obejme" DNA kolem dokola
- v molekule enzymu tři smyčky, které v nespecifickém komplexuw,K -f jsou neuspořádány, vytvoří specifický kontakt s DNA ^^J^SwSF^' ve velkém a malém zlábku -> ^1M™fÄ ^ -tzv. R-smyčka vytvoří 12 přímých vodíkových         w0     \ vgSKĚ vazeb s bázemi, 12 vazeb zprostředkovaných molekulami vody s fosfáty a dva van der Waalsovské kontakty s vnějšími thyminy
-O-smyčka („bohatá na glutamin") tvoří čtyři vodíkové vazby s hranami bází v malém žlábku a obsahuje Asp74, který má katalytickou funkci; tam je rovněž do komplexu zapojen horečnatý ion
-centrální bp nevstupuje do žádné přímé interakce (tam je v důsledku ohybu hluboký a úzký malý žlábek)
-dalších 24 aminokyselin (mimo R a Q smyčky) tvoří vodíkové nebo iontové můstky s fosfáty
interakce je vysoce specifická: k téměř úplné inaktivaci komplexu vtátřízená substituce aminokyselin, které tvoří vodíkové vazby s bázemi, mutace restrikčního místa (včetně centrálních bp, které netvoří přímé vodíkové vazby), a ve většině případů i chemické změny fosfátových skupin (nahrazení kyslíků) a sbstituce aminokaselin s nimi interagujfcích (např. za alanin)
Využití restriktáz
téměř výhradně typu II
- fyzikální mapování: štěpí v přísně specifických místech na fragmenty, jejichž počet relativně není vysoký ^__
3
3
i
-   1   2 3   12 13 23 123
tma    »0M»     JKWK ■** 9**9f
=>sp,kvenování DNA
-konstrukce rekomhinantních molekul (zejm. využití „lepivých" konců) __ TAGC__-
I
TAGC "ÄTCG"
TiGACE
-studium rozsahu me.tvlace genomu (dvojice izoschizomerů, z nichž jeden je citlivý a druhý necitlivý k metylaci cílového místa)
Msp I - Hpall CCGG BstNl - EcoRll CC^GG
K - neštěpená DNA H- Hpall M - Mspl
normálně met..   demet. hype™et.
H Ú H M
Metvlázv u prokarvot:
a/ restriktáry typu I a III a komplementární metylázy typu II
b/ dvě další metylázy u E. coli
dam (metyluje adenin v sekvenci GATC)
dcm (metyluje cytosiny v sekvenci CCft GG)
-dloha ne zcela jasná (rekombinace, reparace, iniciace replikace)
Metvlázv u eukarvot:
a/ živočichové: metylace sekvence 5'-£!G- („dubletová") b/ rostliny: navíc ..tripletová" metylace 5'-jQNG-
(zřejmě existují nejméně dvě metylázy specifické pro středový nukleotid
-CCG- a -C^G-)
- u eukaryot nejsou všechna rekogniční místa metylována. metylační vzor je specifický pro danou tkáň
(kontrola exprese genů: metylované geny jsou inaktivní —heterochromatin;
metylace C silně ovlivňuje interakce DNA-protein)
-změny metylačního obrazce během gametogeneze, embryogenéze, maturace
-v somatických buňkách zřejmě probíhá jen „udržovací metylace" (dometylování druhého řetězce po replikaci «)
Změna metylačního obrazce:
1/ v důsledku replikace bez metvlace (po dvou replikacích vznikne jedna
zcela nemetylovaná molekula) -např. v důsledku překrytí rekogničního místa proteinem
NH
2
-5-azacytidin: po inkorporaci do DNA inaktivuje metylázu => demetylace genomii^j^ (včetně konstitutivního heterochromatinu 1 Jj
- druhý chromozom X u samic) |
21 metylace de novo - větší význam pouze v raných embriích;
=>diferenciace
Metylace RNA -všechny 4 báze; postraskripční modifikace »