REVERZIBILNÍ INTERAKCE DNA S MALÝMI MOLEKULAMI tři základní typy interakcí: 1. nespecifická vněiší vazba podél molekuly DNA - elektrostatického původu (Na+, Mg2+, [Co(NH3)ô]3+, polyaminy) 2. vazba do (malého nebo velkého) žlábku dvoušroubovice interakce přímo s okraji párů bází, ,CH, tvar a flexibilita molekuly itN^í elektrostatické plus vodíkové vazby; 0 f>^w F H NHř í NH, Neiropsin 3.interkalace - planární aromatické (heterocyklické) molekuly mezi páry bází; elektrostatické plus vodíkové plus stacking interakce vyžaduje změnu geometrie dvoušroubovice: změna torzního úhlu, aby se páry bází proflaoin vzdálily (0.34 nm) h. Vněiší elektrostatické interakce DNA: vysoce nabitý polvelektrolyt; náboj fosfátů ovlivňuje strukturu a interakce Manning: teorie kondenzace prdtiiontů (counterion condensation) v B-DNA připadá 1 náboj na každých 0.17 nm (dva náboje na nukleotid a 10 bp na otáčku) avšak: v nepřítomnosti „protiiontů" by byla molekula nestabilní při větší hustotě nábojů než jeden na 0.7 nm stabilitu při tak vysoké hustotě náboje zabezpečují kationty, které „kondenzují" podél dvoušroubovice dokud hustota náboje neklesne pod jeden na 0.7 nm (což je sice entropicky nevýhodné, ale více než vyváženo výhodnými interakcemi v dvousroubovici) další ionty jsou vázány na zbývající záporné náboje ve smyslu Debye-Hiickelovy teorie (iontová atmosféra) Pro danou konformaci DNA je počet kondenzovaných iontů (hustota náboje) konstantní (v širokém rozmezí koncentrace iontů v roztoku) ionty nejsou vázány na specifickém místě, rychle se vyměňují a migrují podél molekuly pokud se odstraní náboje fosfátů (esterifikace. PNA), tvoří sice molekuly dvousroubovici, ale nejeví obvyklé efekty v závislosti na iontové síle (závislost Tm, asociačních konstant kationických ligandů) v B-DNA připadá najeden fosfát 0.76 „kondenzovaného" monovalentního kationtu a 0.88 celkem (kondens. plus Debye-Hiick.) Vliv „kondenzovaných" iontů na konformaci a naopak- se změnou geometrie dvoušroubovice se mění lineární hustota náboje (např. interkalace => prodloužení molekuly =>uvolnění protiiontů -platí i pro nenabitý interkalátor !) Kationty s více náboji - silnější interakce, vytěsnění jednovazných (přechodné kovy - navíc koordinační vazby na báze, v tomto případě tvoří „pevné" komplexy, tj. ion „drží" na určitém místě. Pokud tento efekt převáží nad kondenzací, zvýšení koncentrace iontu vede ke snížení Tm: v ss DNA jsou báze přístupnější) tří- a vícevazné kationty (hexaamminkobaltitý. polyaminy) indukují (v nepřítomnosti dvou- a jednomocných iontů) „kolaps" molekul DNA (při její nízké koncentraci) do vysoce kondenzovaného stavu ísilná neutralizace nábojů plus iontové můstky); při vyšší koncentraci DNA se tvoří agregáty a dochází k precipitaci Voda silně vázaná: interaguje specificky s náboji fosfátů a polárními skupinami cukru a bází; vliv na stabilitu a interakce DNA další molekuly interagují méně pevně->postupný přechod do „volného" stavu fosfát Nespecifické vněiši „stacking" interakce interakce mezi planárními molekulami v roztoku (di- a „vícemery") ve smyslu vertikálních interakcí (jt-Jt) pokud jsou nabité (proflavin), odpuzují se; pokud ovšem zároveň interagují s opačně nabitvm polvelektrolvtem (DNA), mohou vytvořit stacking komplexy podél jeho molekul (vnější stacking planárních kationtů); efektivní jen při nízké iontové síle planární V kation stacking Vazba do žlábku (groove binding=> dále g.b. molekuly) malé molekuly - většinou do malého žlábku proteiny, oligonukleotidy - do velkého (oligos: Hoogstenovo párování) Typická molekula vázající se do m.ž.: několik aromatických kruhů (benzen, furan, pyrol) spojených vazbami s torzní volností ,CHj \ O? ■ Netropsin Hoechst 33253 -molekuly mohou „zapadnout" do žlábku, mohou opsat jeho helikální zakřivení -vytěsní molekuly vody -obecně preferují A:T oblasti - kde ja malý žlábek užší a lépe tam příslušné aromatické molekuly „pasují" a vytvářejí ve srovnání s G:C oblastmi silnější INTERAKCE: -van der Waalsovy vazby na řetězec, který tvoří stěny žlábku: v A:T těsnější -vodíkové vazby s bázemi: na 02-T a N3-A v GC párech je sterické bránění aminoskupinou G (tvoří vodíkovou vazbu 02-C, která sama leží v malém žlábku) -negativní elektrostatický potenciál je větší v A:T úsecích než v GC (G.B. molekuly jsou zpravidla katioňty) Obecně existuje u G.B. látek možnost rozpoznání specifické sekvence (na rozdíl od interkalátorů): G.B. molekuly mohou obsáhnout několik pár bází nodél řetězce fkromě látek vázajících se do malého žlábku též nanř. Netropsin: známa krystalová struktura s f*3 | j-n oligonukleotidem _ o \J <* ^ T % CGCGAAIICGCG ííN^N \ L, váže se na sekvenci A ATT sNH|. Netropsin tvoří amidové skupiny vodíkové vazby s N3-A a 02-T pyrolové kruhy jsou vzájemně zkříženy o asi 33 0 vazba netropsinu způsobuje ohyb osy dvoušrobovice a mírné zavinutí v A:T oblastech (=> příprava pozitivně superhelikální DNA) v GC - mnohem slabší vazba; při náhradě pyrolových kruhů imidazolem (=>Jexitropsiny), který je akceptorem vodíkové vazby z aminoskupiny G => zvýšená vazba v G:C oblastech fíoechst 33258 - antibiotikum, barvení chromozómů, stranovení DNA (fluorescenční komplex) krystaly se stejným oligonukleotidem jako netropsin: vazebné místo je spíše ATTC Hoechst 33258 Interkalace zač. 60 let, Lerman: interakce DNA s planárními organickými kationty interkalace - vmezeření planární molekuly mezi sousední párv bází -to vede k prodloužení molekuly DNA (o efektivní tloušťku interkalátoru, asi 0.34 nm podle klasického modelu)=>změna hydrodynamických vlastností -to je spojeno s vzájemnou torzní rotací párů bází, zmenší se twist (z obvyklých 36 °) a zvětší počet bp na otáčku cukrfosfát. "Kostra interkalátor v kovalentně uzavřené kružnicové DNA se v důsledku toho zvětší počet nadšroubovicových závitů (tj. negativně scDNA se relaxuje, relaxovaná přechází na pozitivně sc) =>příprava topoizomerů VW--0 Wr>0 7V<0 Wr<0 změna torzního úhlu (odvinutí dvoušrouboviceV ethidium a propidium 26 °, akridiny (proflavin) 17 °, daunomycin, adriamycin -11° G.B. molekuly DNA neodvíjejí (neropsin: zavinutí) dichroismus - planární cyklické systémy poskytují podobné chiroptické parametry jako páry bází anizotropie polarizace fluorescence (např. ethidium): studium konformace DNA (G.B. molekuly mívají dichroismus opačný) interkalace vede ke zploštění „vrtulového zkrutu" párů bazí, interkalátor a přilehlé bp mají navíc „tilt" 20-25° (zesílení stacking interakcí s interkalátorem) Twist Propellor Twist avšak: interkalace nezpůsobí celkový ohyb DNA (lokální změny parametrů se zprůměrují) INTERAKCE: elektrostatické - kationické interkalátory vs. fosfáty stacking - s páry bází vodíkové vazby (obvykle exocyklických aminoskupin - např. ethidia, proflavinu - na kyslíky v fosfodiesterových vazbách) STRUKTURA: klasické interkalátory obsahují 2 - 3 kondenzované aromatické (heterocyklické) kruhy a kladně nabité skupiny (často amino-, kvartérní dusík...) (G.B. molekuly: cykly nejsou kondenzované, mohou vzájemně rotovat - ale též „neklasické" interkalátory) NH. proflavin Br ethidium (bromid) sCH2CH3propidium: místo ethylové skupiny -(CH2)3N+(CH3)(C2H5)2 (bývá jako iodid) fenylová skupina brání dokonalé interkalaci=> určitý „kink" v místě vazby tyto postranní skupiny v malém žlábku barvení gelů, jader, stanovení DNA (fluorescenční komplex) příprava topoizomerů, izolace scDNA v CsCl-gradientu CH2CH3 Chloroquin CH j_CH2CH3 ^äbší interkalátor NH—ČH—(CH2)3 -stanovení superhelikální hustoty gelovou elektroforézou -2D-elektroforéza: sledování strukturních přechodů v scDNA řada antibiotik: adriamycin, daunomycin, doxorubicin Vazebná specifická jednoduché interkalátory interagují jen s dvěma bp (G.B. molekuly s více) => deset možností vazebných míst: 5' 3" 5' (postranní řetězce mohou ovlivňovat i další bp) většina interkalátorů poněkud preferuje G:C páry (G.B. molekuly A:T) důvod - obecně větší vnitřní dipólmoment v G:C páru, který indukuje polarizaci v molekule interkalátorů 3" 5' 3' interkal. s preferencí k A:T byly syntetizovány obecně je selektivita G.B. molekul větší než interkalátorů (protože „dutiny" mezi A:T a G:C páry se málo liší co do elektrostatických, van der Waalsových, hydrofobních atd. interakcí; na druhé straně žlábky v A:T a G:C oblastech jsou velmi „vyloučení sousedního místa" (neighbour exclusion): obecně by mohl interkalátor obsadit všechna místa mezi bp (tj. stejný počet molekul jako bp), ale v praxi je saturovaná DNA interkalátorem obsazena jen asi z 1/2 - střídavě, jen každě druhé místo: jestliže je jedno místo obsazeno, na sousední se nenaváže -z konformačních důvodů (změna indukovaná interkalací další interkalaci v sousedství znemožní) -z elektrostatických důvodů (první interkalátor neutralizuje negativní náboj DNA, vazba druhého cv sousedství je méně výhodnáú) - některé bisinterkalátory »toto pravidlo porušují rozdílné) Bisinterkalátory syntetické: dva planární interkalující cyklické systémy spojené řetězcem, který může mít varabilní délku (např. methylenové skupiny) -zvýšení vazebné konstanty (význam např. u léků) -pokud je spojující řetězec příliš krátký, molekula může porušit např. bisakridin s oligomethylenovým linkerem pro n<4 se váže jen jako monointerkalátor, drahá akridinová skupina je vn< n=6 - bisinterkalace s^Dfusením pravidla vyloučení n>8 - bisuTtefk^lace bez porušení Wh -i (modelový systém, který tak ve skutečnoati možná nefunguje; existují však rigidní molekuly, které se prokazatelně bisinterkalují s porušením pravidla) echinomycin a triostin A přírodní antitumorová antibiotika cyklické peptidy tvořící relativně rigidní rovinu se dvěma chinoxalinovými kruhy kolmými k této rovině ideální konfigurace pro bisinterkalaci (neporušuje pravidlo vyloučení: mezi se vejdou dva bp) preferují G:C páry mezi interkalujícími skupinami L-Ma L-NM»Cy» CH, CMj " LJ CH, b L-/VM«Vil cen CH2 D-Ser Trionin A, R --CH2—s-s-CHj-Echinomyeln, n «-CH—s—CHj— n L-ATMsVd SCH, —1 QuinoMBlina j —j QuinoK»l í 19-1 EED i krystalová struktura triostinu s GCGTACGC cyklický peptid je v malém žlábku NH skupiny alaninovvch zbytků tvoří vodíkové vazby s N3 obou G. jejich karbonylové skupiny s aminoskupinami G-> důvod specificity v krystalu mají adeniny v A:T párech opačnou konfiguraci (syn-) a tvoří Hoogstenovo párování, stejně jako koncové G:C (tam je to přakvapující, protože C v Hoogstenově páru by měl být protonizován) (to neplatí pro „dlouhou") DNA v roztoku G c [mm] km) Base-pair type H M- W-C w-c H -4 H ^ W-C w-c tyto krajně neobvyklé konformační změny DNA jsou energeticky kryty tvorbou komplexu - to je obecnný jev u konformačních změn indukovaných vazbou jakékoli molekuly Neklasické interkalátory Interkalátory s více objemnými skupinami - pokud jsou na opačných stranách molekuly, musí se jedna z nich pri tvorbě komplexu „protlačit" skrz dvoušroubovici mezi bp => pomalý krok, kinetický blok pro tvorbu komplexu (zejména pokud jsou postranní řetězce nabité nebo polární) OH O NHCH2CH2NH2CH2CHiOH kationické porfyriny X - 2H, TMPyP X - Ni(ll), NillIKTMPyP X - Zn(lt), Zn(ll)-TMPyP mitoxantron NHCHiCHjNHjCHiCHjOH vazba jednoduchého klasického interkalátoru (proflavin) je dvoustupňová: 1. nespecifická iontová interakce s DNA a lineární difuse k místu, kde 2. vstoupí do interkalačního komplexu u molekul s objemnými skupinami vyžaduje druhý krok významnou distorzi struktury DNA nebo i přerušení vodíkových vazeb v hp => pomalu boční řetězce tvoří výhodné interakce např. ve žlábcích, nebo elektrostatické s fosfáty => vysoké vazebné konstanty (navíc je kineticky blokována i disociace interkalačního komplexu Interkalátorv s „vrtulovým zkrutem" - nekondenzované cyklické systémy (jako G.B molekuly) - mají torzní volnost (CH3)2N— vazba do žlábku není výhodná PAPI (4',6-diamidino-2-fenylindol): (barvení jader) p způsob vazby odráží vlastnost^ DNA v závislosti na sekvenci: v A:T oblastech se váže do žlábku v G:C oblastech se interkaluje (v A:T místech je vazba do žlábku výhodnější než v G:C, při interkalaci je tomu mírně naopak) Činidla štěpící DNA antibiotika - bleomycin A2 a deriváty O^NH2 H NH2 NH2 bithiazolová část se interkaluje nebo G.B. hie * OH •4-M V-O-^-^OH OH j tato část může tvořit komplexy s kovy bleomycin štěpí DNA se selektivitou pro Pu.Py sekvence, značný podíl dvouřetězcových zlomů nejčastěji komplexy s Fe(II), aktivovaný je ternární komplex bleo-FedD-Ch po jednoelektronové redukci na radikál (další molekulou bleo-Fe(II)->bleo(Fe(III); oxidovaný komplex se může reaktivovat thioly nebo askorbátem; reakcí s peroxidem vodíku vzniká aktivovaný komplex přímo r bleo-Fe(III)) ■o— * R'—OH 'o2 V ©o' l—V, 0^7 -ActivaHd^Aj)^/ H«""\ / bleomycin" 'X / B—CH=CH—CHO Base propenal \1 v OR C°CHO \_/ +BH Or* í-ee base 1—ut" OR CHO • R'OH reakce začne odtržením vodíku z 4' uhlíku deoxyribózy, čímž vznikne radikál v DNA - v konečném důsledku vznikají volné báze a bázemi substituované propenaly, a zlomv v Umělá činidla štěpící DNA (vesměs kovové komplexy) -porfyrinv -rCu(ID(phen)2l činidlo pro footprinting, neselektivní chemická nukleáza v přítomnosti Fe(II), O2 a redukčních činidel methidiová část se interkaluje EDTA jev malém žlábku v reakční směsi jsou generovány hydroxylové radikály (ty jsou - na rozdíl od bleomycinu - volné, mohou difundovat - ale na rozdíl od volného Fe/EDTA činidla - vznikají přímo v blízkosti DNA, kterou štěpí distamycin-EDTA : podobný, ale selektivita pro A:T oblasti adukty EDTA s homoPy oligonukleotidv: štěpem v homoPu.homoPy sekvencích, které s činidlem tvoří triplex -methidiumpropvl(EDTA) (MPE): H CH2CH2NR2 — EDTA-» R - CHjC028 R Metalointerkalátory centrální atom: Ru, Rh, Os, Co... náboj ovlivňuje způsob intarkce (interkalace vs. elektrostaticky) struktura Ugandu rovněž (interkalace vs. do žlábku) interkalace studie struktury DNA přenosu náboje v DNA hybridizace DNA, vývoj senzorů interakcí s proteiny