SntemkcQ <W>01 s proteiny
-veškeré funkce DNA: replikace, transkripce, rekombinace, regulace těchto procesů, opravy poškozené DNA
-výstavba chromatinu (a analogických struktur u prokaryot)
-interakce sekvenčně specifické: zejm.vodíkové vazby, solné můstky se zbytky bází v malém a velkém žlábku dvoušroubovice
-interakce sekvenčně nespecifické: obecně interakce s cukrfosfátovým řetězcem
funkční skupiny v párech bazí, které mohou vstupovat do interakcí s aminokyselinami
velký žlábek
velký žlábek
(+)
^ malý žlábek
velký žlábek
velký žlábek
malý žlábek
malý žlábek
vodíková vazba Hj| van der Walisova interakce (+) elektrostatická interakce
Velký žlábek: jeden donor a dva akceptory vodíkové vazby u všech bp; metylová skupina u T (a u
5-meC) .    i   * \
Malý žlábek: dva akceptory vodíkové vazby u všech bp; u CG a G.C navíc je N2 (aminoskupma)
G donorem vodíkové vazby
rozmístění interakcí je charakteristické pro každý bp
FUNKČNÍ SKUPINY AMINOKYSELIN a/ nepolární boční řetězec
Loof
3NH3+
isoleucin (I)
fenylalanin (F)
tryptofan (W)
b/ polárni
H
^HO—CHrC—COO-NH3+
serin (S)
Y
tyrosin (Y)
CH3—cpi^^—COO-
O NH3+ H
X threonin (T)
f1
CH-2-p—COO-NH3+
HS—CH-rC—COO-cystein (C)
\ f
y—cH2-<p—coo-
H2N NH3+
asparagin (N) glutamin: delší o -ch2-
c/nabitv
-\Sg—1
qN?—CH2-p—COO-^H^- O NH 3+
kyselina asparagová (D) glutamová (E): delší o -ch2-
® í
H3N-CH2-CH2-CH 2-CH-2-C—COO-
I
NH.+
lysin (K)
:HN
H
CH-2-C—COO-WH3+
histidin (H)
H
"♦58H2N
)c-NH-ffl-2<H-2-CH-2G—COO
arginin (R)
NFJVÝHODNČ.TŠf INTERAKCE hp SE ZBYTKY AMINOKYSELIN . (těch, které tvoří více vazeb)
+H3N-i-COO- ^N-n-ojO-
pp3     velký žlábek '(Afa velký žlábek
O
H
asparagin a glutamin tvoří dvě vodíkové vazby s adeninem v A.T nebo T.A páru ve velkém zlábku
""^^ malý žlábek +h3n^cií<:oo-^
v malém žlábku tvoří asparaain a olutamin dvě vazby s guaninem
arginin podobně s guaninem
ÚLOHA MOLEKUL VODY
-hydratační obal DNA a proteinů musí být rozrušen
-jednotlivé molekuly vody často tvoří můstky zprostředkující vodíkové vazbv mezi mokulami DNA a proteinů (např. v trp operátoru jsou všechny vodíkové vazby zprostředkovány vodou; v X-represoru byly identifikovány tyto struktury:
H
-o-^-cX^ribóza
Q- •
H
/
H—N
C=0«IIH—N
qj2 >
Gln33/CH2 ^ G!n44
V g
/Ser45
NEPŘÍMÉ ROZPOZNÁNÍ URČITÝCH SEKVENČNfCH MOTIVŮ V DNA: -vazba proteinů citlivá na specifickou sekundární strukturu DNA, která je daná určitou sekvencí (ta určuje lokální „twist", „tilť\ „roli" bází, ohyby dvoušroubovice a šířku žlábků a tím přesnou vzájemnou polohu donorových a akceptorových skupin vodíkových vazeb jak v bp, tak v cukrfosfátové kostře - její geometrie často postačuje ke specifickému rozpoznání určité oblasti v DNA určitým proteinem)
ZÁKLABMÍ STRUKTURNÍ MQTTVY PROTEINŮ
a-heíix
-pravotočivá šroubovice s 3.6 aminokyseliny na otáčku
-stabilizace vodíkovými vazbami mezi vodíkem amidové skupiny a karbonylovým kyslíkem o čtyři aminokyseliny dále
-postranní funkční skupiny aminokyselin jsou exponovány vně helixu a přístupné interakci s funkčními skupinami v DNA nebo s jinými segmenty téže molekuly proteinu (terciární struktura) či s dalším polypeptidovým řetězcem (kvarterní struktura)
^-(skládaný) list
-řetězce uloženy lineárně vedle sebe, anuparalelnTnelx) paralelně (mohou být ze stejné nebo různých molekul); relativně plochá struktura
-stabilizace vodíkovými vazbami mezi vodíkem amidoskupiny a karbonylovým kyslíkem
-postrannífunkční skupiny aminokyselin směřují nad a pod rovinu p-listu
r-c-h........       h~e~ft -
sC = Oct(H-N^
\   < F~* .
)■■.....h-e-tt.....• rh^-h—i
/0=< N-H / N-H»'0«C^
----«-c£*— hhs~r.....
\ mV P-o
\-......«-fe-ft-----Ä-C^H-
/0»<
N-H »'0 = Cv
ŕ—-ft-C-H-------- H-C-R -
vC=0«cH-H4 \ H-< >-0 - -H-C-fl------*-C--H
a-helix obvykle interaguje s DNA ve velkém zlábku (osa helixu ve směru dlouhé osy žlábku)
-postranní skupiny proteinu mohou interagovat s fosfátovými skupinami i pronikat žlábkem dovnitř dvoušroubovice a interagovat s páry bází (pravděpodobná tvorba specifické vazbay)
uP-Ustu se předpokládá nespecifická vazba do malého žlábku, kde vytváří vodíkové vazby amidoskupin peptidové vazby a fosfáty
INTERAKCE MOTIVU HEIJX-OTÁČKA-HELIX S DNA
Basfe Pair
-dvacetiaminokyselinový motiv nalezený u řady proteinů interagujících s DNA - 8 AKv helixu, pak pravotočivá otáčka z% tří AK a další helix z 9 AK
-přičemž jsou konzervovány: alanin v pozici 5, glycin 9 (první ak v o\ä£cč)isoleucin nebo valin v 9 (tyto AK zřejmě udržují strukturu motivu)
-v ostatních pozicích vysoká heterogenita (zachována je hydrofilita těch částí helixů, které směřují „ven z proteinu" do rozotku nebo k DNA; „vnitřní" povrchy helixů jsou hydrofobní)
-interaguje s DNA ve velkém žlábku, jemuž odpovídá rozměry (typický a-helix má průměr 1.2 nm, velký žlábek je v b-dna 1.2 nm široký a 0.6 - 0.8 nm hluboký)
-pokud je a-helix paralelně se žlábkem, může interagovat s 4-6 bp, než žlábek „zahne"; na této délce dochází k rozpoznám specifické sekvence určitými AK
X-represor
-236 AK protein, dimerní -dvě funkční domény: N-koncová (AK 1- 92)se váže na DNA, C-koncová má dimerizační funkcí
-N-koncová doména sestává 5 a-helixŮ; z nich 2. a 3. a pět AK mezi nimi vytváří helix-otáČka-helix motiv
-řada specifických vodíkových vazeb na bp — (Asn, Gin, Ser, Lys)
-Lys 4 tvoří solný môstek G v šestém bp
-van der Waalsovy kontakty(mezi hyaVofobmmi skupinami proteinu a metylskupinami T
-vazby zprostředkované molekulami vody
-interakce helixu 3 s fosfátovými skupinami;:
PaPb p^Pd'Pc
tpapTpApTpCpApCpCpGpCpCpApGpTpGpGpTpAptpt aptpApTpApGpTpGpGpCpGpGpTpCpApCpCpApTpapa A A A A A
PcPdPe PbPa
vzhledem k otáčce dvoušroubovice jsou vyznačené fosfáty A-e a A'-e' vždy ve stejném místě velkého žlábku (značení odpovídá převrácené symetrii operátoru)
-vodíkové vazby s fosfáty tvoří dvě třídy: a/vazby ve velkém žlábku tvořené motivem helix-otáčka helix a helixem 4
íi/mimo velký Žlábek od aminokyselin z helix 1 a AK mezi helixy 1 a 2
INTERAKCE Zn-VAZEBNÝCH DOMÉN S DNA
-velký počet proteinů specificky interagujících s DNA váže zinečnaté ionty (často regulační proteiny)
-tři typy Zn-vazebných domén:
Zinkový ..prst" - ZnfCvsi-His?) ,
transkripční faktor IIIA:(1985) třicetiaminokyselinový repetitivní motiv, v němž jsou konzervovány tyto aminokyseliny: -►
/ """"^
-cysteiny a histidiny koordinují
zinecnatý ion
ß-list
a-helix
VTFniAje<fev# těchto motivů, vazebné místo zahrnuje 27 bp -na obou koncích tři vnější „obtáčeje dvoušroubovici a sledují směr osy velkého žlábku (interagují vždy s 10 bp - trojice) -tři centrálníinteragují napříč malým zlábkem z jedné strany
dvouŠroubovice:
1 (F)    4 9 13 19 22 Xb
T G E K *  J  P©V<g)* • D G©P K B©T K K • • ©K *  R{§)' • *  *<H)T G E K
a-helix
P-Ust p-list
zbytky 2-14 a 3-17 tvoří antiparalení p-list, z jehož jedné strany váží cysteiny 4 a 9 Zn
zbytky 16-27 tvoří a-helix, který je „přidržován" podél (3-listu koordinací histidinů 22 a 26 se Zn
GOCH
Protein Zíf268 : kokrystalová struktura
-tři Zn-prsty váží 11 bp sekvenci A fiCfi TGfí £C£ T, každý k jednomu podtrženému trinukleotidu
-protein „obtáčí" DNA podél velkých Babků a váže se na guaniny v rekogniční sekvenci
-N konec každého ct-helixu směřuje do velkého žlábku
-před helixem každého prstu je arginin (polohy 18,46,84), který
tvoří vodíkovou vazbu s posledním guaninem každého tripletu
-helix prvního a třetího prstu ma uprostřed další arginin (24 a 80),
vázající se na první guaniny příslušných tripletů; v prostředním helixu
je histidin (49), vázající centrální guanin
-množství vazeb na fosfáty
-struktury zcela odlišná od helix-otáčka-helix!
Zn..twist" - fZn(Cysd)fr doména
receptory pro steroidní hormony (glukokortikoidy, estrogeny):(1990) -šedesátiaminokyselinová vazebná doména, obsahuje dvě oblasti -každá s dvěma cysteiny; vysoce konzervativní -vazebná doména je uspořádána do globulární struktury tvořené
dvěma na sebe kolmými a-helixy__ " ■ "
-Zn je vázán poblíž N-konce a-helixů, které obsahují množství bazických zbytků soustředěných na jedné straně helixú -tyto zbytky tvoří množství specifických vodíkových vazeb ve velkém zlábku DNA
- vazebné místo DNA je dimerní, zcela symetrické
AAAAAAAl
VWVAAfa ^
Zn.Mastr" - ZniiCysf,) doména
kvasničný transkripční faktor GAĹ4 -třicetiaminokyselinová vazebná doména, obsahuje šest cysteinových zbytků
-rozmístění cysteinů je vysoce konzervativní u řady druhů kvasinek a hub
-vždy dvojice cysteinů váze zinek, dva atomy Zn jsou spojeny můstkem z další dvojice: CyS2-Zn-CyS2-Zn-CyS2
-cysteiny jsou organizovány okolo dvoujaderného zinkového
klastru do dvou a-helixů, spojených smyčkou na druhé straně
atomů zinku (po dvou cysteinech v helixech, dva ve smyčce)
- jeden z helixů interaguje s DNA ve velkém žlábku s tripletem
CCG
-vazebné místo DNA je dimerní (celkeml7 bp), podjednotky spojené „svinutým klubkem" (coiledcoil) hydrofobních zbytků interagují z opačných stran dvoušroubovice (CCG triplety jsou separovány 1.5 otáčky dvoušrouboviceji
LEUCINOVÝ ..ZIP'
Trankripční faktory rodiny bZip (kvasničnéfaktory GCN4, onkoproteiny fos a jun)
-obsahují dimerizační doménu a bazický motiv interagující s DNA -dimerizační doména - tzv. leucinový zip - je tvořena amfípatickým a-helixem, ve kterém je každá sedmá AK leucin: protože otáčka a-helixu je 3.6 AK, vychází všechny leuciny na jednu síranu helixu (ob otáčku)
-dimerizační domény obou podjednotek spolu interagují hydrofobními vazbami leucinů, tvoří „svinuté klubko" -vazebná doména obsahuje bazické AK zbytky -monomer GCN4 obsahuje 56 AK a tvoří jeden kontinuální a-helix; 30 zbytků tvoří leucinový zip, 25 zbytků bazickou doménu
-"zip" je v komplexu s DNA orientován kolmo k dvouŠroubovici a vazebné části jsou „nastaveny" do velkého žlábku na opačných stranách -ve velkém žlábku tvoří vodíkové vazby zbytky Asp, Ser, Arg, Lys s bázemi a fosfáty
TATA-box -vazebné proteiny
-TBP: DNA-vazebná podjednotka proteinového komplexu, který rozpoznává TATA-box (8 bp)
-TBP je tvořen sedlovitě zakřiveným ^-listem z 10 antiparalelních
řetězců.; na vrcholu téo struktury jsou 4 ct-helixy
-při tvorbě komplexu se DNA zakřiví podle tvaru proteinu (o 100° ve
směru malého žlábku); to způsobí odvinutí TATA boxu o 110°
-malý žlábek je otevřen, bp jsou exponovány uvnitř „sedla"
- na koncích TATA-elementu jsou mezi bp (tj bp 1,2 a 7,8) vsunuty
dvě dvojice zbytků fenylalaninu
- DNA v těsném sousedství komplexu y    1 \\ \
je normální B-forma! _ \\\ \v\ \
INTERAKCE p-LISTU S DNA
-P-list obvykle leží v malém žlábkuatvoří vodíkové vazby s fosfáty'DNA
-dvě možné orientace: výhodnější interakce, je-li N-konec fí-listu ve směru 3'->5' toho DNA
řetězce, se kterým tvoří vodíkové vazby ...
HU-proteiny, rodina malých bazických bakteriálních proteinů
-váží se na DNA nespecificky, indukují ohyby, „konzervují" negativní superhelicitu in vivo Oejich vazbou na negativně sc DNA se relaxuje zbytek molekuly, takže molekula není relaxována topoizomerázou)
ligace
deproteinafce.
volná molekula scDNA zavedením jednořetězcového zlomu zrelaxuje, superhelicita se ztratí
vazbou na HU-protein se spotřebuje část superhelicity (tj. AWr, zakřivení DNA okolo proteinu); volná část molekuly je relaxovaná, takže její topologický stav se zavedením zlomu nezmění: superhelicita je „uvězněna" (restrained) ve vazbě na HU protein
v HU-proteinech ie p-list ze tří řetězců; dva (antiparalelní) z nich pokračují v dlouhé rá^neno tri a-helixy vytvářejí strukturu, která interaguje s d podjednotkou za tvorby dimeru v dimeru tvoří ramena „račí klepeto", které obejme dvoušroubovici DNA;
(3-listy interagují v malém žlábku (ramena jsou zahnuta tak, aby byla interakce co nejvýhodnější, a obsahují vysoce konzervované zbytky AK, zejména bazické: Arg. Lys. které interagují s fosfáty) - vazba je sekvenčně nespecifická
sekvenčně specifická interakce p-listu:
např, Metl-represor z E.coli: p-list tvoří ve velkém žlábku speciifcký kontakt s
palindromickou sekvencí AGACGTCG; taje 5x tandemově opakována
vodíkové vazby tvoří zbytky Lys a Thr z p-listu s druhým a třetím nukleotidem (G a A)
Interakce restrilctáz typu II $ DNA
- velká podobnost jednotlivých enzymů
- společné reakční schéma:
nespecifická interakce kdekoliv na molekule -> lineární difuse k restrikčnímu místu -> tvorba specifického komplexu spojená s konformačnízměnou proteinu i DNA -> Štěpení DNA
DNA (z „půdorysu")
Nespecifická vazba
-relativně slabá za podmínek optimálních pro štěpení (tj. mM Mg2+)
- silnější v nepřítomnosti hořčíku
- značně závisí na koncentraci solí: to ukazuje na značný elektrostatický příspěvek (tj. iontové interakce s fosfáty)
Eco RV: nejlépe prostudovaná:
-komplex je držen pohromadě pěti kontakty aminokyselin z každé podjednotky s cukrfosfátovou kostrou
-katalytické centrum není v nespecifickém komplexu v aktivní konformaci a ty Části molekuly, které interagují s restrikčním místem, nejsou „správně" uspořádány
- v těchto částech je volně vázáno velké množství molekul vody (~100 na holoenzym) a iontů, které jsou při tvorbě specifického komplexu uvolněny
(interference s vazbou/uvolněním molekul vody, např. osmotický tlak, je zodpovědná za tzv. „hvězdičkovou aktivitu", tj. méně stringentní Štěpení)
-"nasednutí" enzymu na DNA v kterémkoli místě a hledání restrikčního místa podel řetězce (= redukce na jednorozměrný problém) zvyšuje pravděpodobnost a rychlost jeho nalezení např. EcoR / postupuje rychlostí 7xl0-6 bp/s !!
- enzym ..klouže" podél molekuly DNA a opisuje helikální zkrut; děj je podmíněn citlivou rovnováhou přitažlivých a odpudivých elektrostatických sil
(alternatívni mechanismus - „skákánf \ tj. mikroskopické disociace/asociace- není pravděpodobný: enzym nepřehlédne" žádné reštrikční místo a může být zablokován neobvyklou strukturou DNA, např. triplexem; navíc se „odráží' od konců lineární DNA)
- "hvězdičková" místa enzym ..zdrží" až na 20 S (i za optimálních podmínek, kdy nejsou štěpena; enzym „ověřuje", zda není na „své" sekvenci, a poté pokračuje, čas, po který se „zdrží", koreluje s podobností místa ke kanonické sekvenci a tedy s relativní afinitou enzymu k danému místu)
Specifická vazha a roznoznánť restrikčního místa
-nejlépe prostudován je enzym EcoRV (GATATC)
- ve specifickém komplexu je DNA ohnuta o 55°, čímž je místo „odvinuto", u cetrálních bp porušena stacking interakce
- komplex je těsný, enzym těsně „obejme" DNA kolem dokola
- v molekule enzymu tři smyčky, které v nespecifickém komplexu* co,82   . r < jsou neuspořádány, vytvoří specifický kontakt s DNA «^ JK" \\ ve velkém a malém žlábku                                           *"1<? r -tzv. R-smyčka vytvoří 12 přímých vodíkových ^t^S^^ vazeb s bázemi, 12 vazeb zprostředkovaných molekulami    ^^Sľ^^-ir ^ vody s fosfáty a dva van der Waalsovské kontakty A^s-—^Qgpp s vnějšími thyminy                                                ť :v;^>■■, -O-smyčka („bohatá na glutamin") tvoří čtyři vodíkové     ' \ /jl*1*^ T * vazby s hranami bází v malém žlábku a obsahuje Asp74,            *l     C - G který má katalytickou funkci; tam je rovněž do komplexu zapojen horečnatý ion
-centrální bp nevstupuje do žádné přímé interakce (tam je v důsledku ohybu hluboký a úzký malý žlábek)
-dalších 24 aminokyselin (mimo R a Q smyčky) tvoří vodíkové nebo iontové můstky s fosfáty
interakce je vysoce specifická: k téměř úplné inaktivaci komplexu vedeřízend substituce aminokyselin, které tvoří vodíkové vazby s bázemi, mutace restrikčního místa (včetně centrálních bp, které netvoří přímé vodíkové vazby), a ve většině případů i chemické změny fosfátových skupin (nahrazení kyslíků) a sbsíituce aminokaselin s nimi interagujfcích (např. za alanin)
DlMERNf VA7.ERNÁ MÍSTA
-častý jev zejména u regulačních proteinů (dimerní rekogniční místo interaguje s dimerní nebo tetramerní molekulou proteinu)
-tím se zvyšuje afinita vazby (více vazebných míst ncbovÄf f vazebné místo znamená více interakcí) a její specificita (protein se musí navázat na obě místa současně)
organizace dimerních vazebných míst: v zásadě je možná jako
přímá, převrácená   nebo   zrcadlová repetice:
-nejobvyklejsí je převrácená repetice (lac operátor, X-operátor; restriktázy): nejvíce symetrie
-přímé (tandemové) repetice jsou typické pro proteiny s tzv. ,£n-prstem" -interakce dimemího proteinu se zrcadlovou repeticíje málo pravděpodobná z důvodou nedostatku symetrie takové sekvence v dvouŠroubovici (nicméně případy jsou známy)
pokud je vmezeřeno 10 bp. obě podjednotky proteinu interagují s DNA ze stejné strany
pokud je převrácená repetice rozdělena SJjp, nachází se stejné sekvenční motivy na opačných stranách dvoušroubovice
SEKVENČNĚ NESPECIFICKÉ INTERAKCE
-využívají zejména r.iikrfosfátové kostry, která má relativně uniformní tvar (s výjimkou lokálních změn konformace, které jsou závislé na určité sekvenci) a negativní elektrický náboj
-DNA-polvmeráza I: (musí „projít" celou molekulu a kontaktovat každý bp), interaguje s fosfátovými skupinami
-nespecifická v^ha restriktáz typu II: silná závislost na iontové síle ukazuje na značný podíl elektrostatické interakce; u EcoRV bylo identifikováno 5 vodíkových vazeb na fosfátové skupiny (žádná na báze)
-bakteriální Hl J protein: účast 0-listu zanořeného do malého žlábku, který interaguje vodíkovými vazbami mezi argininovými zbytky a fosfátovými skupinami
-DNáza I: vodíkové vazby mezi 10 aminokyselinami a fosfátovými zbytky; kromě toho stacking interakce mezi tyrosinovým kruhem a pyrimidinovým zbytkem a 3 vodíkové vazby mezi argininovým zbytkem a O-atomy v pyrimidinovém zbytku
Proteiny $ motivem HMG-boxu
(High Mobility Group)
-DNA vazebná doména společná pro řadu proteinů chromatinu, Obecně transkripčních faktorů a transkripčních regulátorů, které řídí diferenciaci a determinaci pohlaví -rozpoznávají zejména konformační- rysy DNA (některé se váží sekvenčně specificky) -HMG-box tvoří asi 70 aminokyselin ; vysoký podíl prolinu, aromatických a bazických aminokyselin
-konzervované zbytky: aromatický v poloze 11, Trp 41, aromát. 52; několik dalších méně konzervativních
-mutace v HMG-boxu dramaticky snižují afinitu k DNA -celkově je HMG box spíše hydrofilní, s hydrofobmm úsekem na N-konci -3 skupiny:     / 1-savčíHMG-l a podobné chromatinové proteiny (ne zcela jasná funkce, J    snad mají úlohu při transkripci tím, že vážou histony a napomáhají tvorbě iniciačního komplexu)
2- transkripčm faktory RNA polymerázy I a mitochondriální proteiny (včetně TBP)
3- poměrně heterogenní skupina zahrnující mj. savčí faktor určující samčí pohlaví (SRY)
indukují ohyby v DNA; jejich možné funkce:
SLEP-I
JUÉM
w
jL£Ft
transkripční faktor LEF-1: v
důsledku ohybu se k sobě přiblíží dva další transkripční faktory
I
HMG-1: možná stabilizace smyček DNA v důsledku „svázáni"' dvou vazebných míst
(tato struktura připomíná čtyřcestné spojení, které HMG-1 in vitro rozpoznává)
progesteronový receptor (PR) s navázaným hormonem se váže efektivně na příslušný DNA element v přítomnosti HMG-1 (ale ne v jeho nepřítomnosti); ten mu může DNA „vytvarovat"