Superhelicita DNA ..ŕ Vtnograd 1965: kružnicová DNA některých virů ve dvou formách, kompaktní formě I (tj. nadšroubovicová, superhelikální) a méně kompaktní formě II (relaxovaná, obvykle otevřená kružnicová) (na základě sedimentčních měřenf) Vinograd, J., Lebowitz, J., Radloff, R, Watson, R. & Laipis, P. (1965). The twisted clrcular form of polyoma víral DNA. Bfochemfstryž 3, 1104-1 1 11. Superhelicita je vlastnost molekul DNA, které nemají VOlné konCe a jejich řetězce tudíž nemohou okolo sebe volně rotovat, tj» a. kovalentně uzavřené kružnicové molekuly (piasmidy,fágovéDNA) b. lineární molekuly S fixovanými konci (např.segmenty eukaryotních chromozómů připojené na jaderné proteinové struktury) % Molekula DNA má mechanické vlastnosti, které lze modelovat např. proužkem gumy: -má určitou elasticitu vůči 1. torznímu zkrutu (twist, Tw) 2. zakřivení osy, ohybu (writhe, Wr ) (a také 3. délce hlavní osy) v relaxovaném stavu má snahu zaujmout (obecně) napřímený tvar a „twist" (a délku) daný parametry dvoušroubovice v příslušném prostředí pokud je topologicky omezena (tj. nemá volné konce - alespoň jeden jednořetězcový zlom) a liší se některým parametrem (Tw, Wr) od relaxované DNA, mluvíme o superhelikální DNA I twist počet závitů dvoušroubovice Lk=Tw+Wr linking number - „molekulární číslo překřížení" -kolikrát protne jeden řetězec druhý, když molekula leží v rovině writhe charakterizuje zakřivení osy dvoušroubovice v prostoru (počet nadšroubovicových závitů) v relaxované molekule DNA v b formě o m<® n párů bazí je Lk = N/10.5 =LkJ> v kovalentne uzavřené molekule je Lk konstantní oze ho změnit jen Pn přerušení alespoň jednoho řetězce) a nemusí bvt rovno Lko : superhelikální DNA je míněna molekula DNA, pro kterou potom (Lk^Lkp =^I^charakterizuje stupeň superhelicity; obvykle se normalizuje velikostí molekuly do tvaru QALk/Lko =CT (nadšroubovicová hustota) Podobně se dají vyjádřit odděleně diference obou složek Tw a Wr od hodnot odpovídajících relaxované molekule: Tw - Tw0 = ATw Wr - Wr0 = AWr potom změna mol. čísla překřížení změna zakřivení osy -dvoušroubovice ALk=ATw+AWr Jf změna počtu závitů dvoušroubovice E^SUperhelícita (ALk) vyvolává „pnutí" v molekule DNA, které má tendenci se kompenzovat změnou její Sekundární (ATw) a/nebo terciární (AWr) struktury Pozitivně superhelikální DNA Lk=Tw+Wr ALk=ATw+AWr Relaxovaná DNA molekula o délce 210 bp Lk = Lko = 210/10.5 = 20 Tw = 20 Wr=0 10 E-15 V reálných případech dochází k distribuci ALk mezi ATw a AWr a k současným změnám celkové a lokální struktury molekula o délce 210 bp Lk = 22, ALk = 2 Tw = 22, ATw = 2 Wr = 0, AWr = 0 Tw = 20, ATw = 0 Wr = 2, AWr = 2 Negativní superhelikální DNA molekula o délce 210 bp Lk = 18, ALk = -2 Tw = 18, ATw = -2 Tw = 18, ATw = -2 Wr = 0, AWr = 0 Wr = 0, AWr = 0 změněn počet závitů dvoušroubovice průměrně podél celé molekuly (tj. torzní úhel u mezi každými dvěma bary bazí) =>změna celkové sekundární struktury lokální změna sekundární struktury: ve zbytku molekuly zůstává „normální"' B-forma Tw = 20, ATw = 0 Wr = -2, AWr = -2 změna terciární struktury: zůstává B-forma dvoušroubovice; to j e umožněno zakřivením její Otevřené lokální struktury -"otevřené", protože jsou charakterizovány sníženým ..twistem" DNA (jsou vzhledem k B-formě DNA odvinuté) a mohou obsahovat nespárované nukleotidy (i denaturační bublina je otevřená lokální struktura) -proto jsou stabilizovánv/indukovánv negativní SUpefhelicitOU: tím, že odpovídají nižší Tw, absorbují negativní superhelicitu - 1111111 ti 1111 u 1111 n i ni i 3 3' i n i t i i i i i i i i 11 i i i i.i li i i i 5' 1 m 1 1 1 1 I 1 1 M 1 1 1 I 1 mini i i 11 i 11 Křížová forma DNA může být vytvořena převráceně repetitivní sekvencí (tj. tam, kde určitý úsek DNA na jednom řetězci je od středu sám sobě komplementární a může vytvořit vlásenku) -každých 10 bp křížové formy relaxuje přibližně 1 nadšroubovicový závit (topologicky je ekvivalentní denaturační bublině ve stejné sekvenci) Cruciform Formation částečná relaxace zbytku molekuly lokální snížení Tw v křížové formě Levotočivá Z-forma DNA může být vytvořena střídavou ťPuPv)n sekvencí (nejlépe GC, ale i AT i smíšené) -každých 10 bp v 2 -formě relaxuje přibližně 2 nadsroubovicové závity (-jeden na odvinutí pravotočivé B-DNA a druhý na vytvoření levotočivé Z-DNA) Intramolecular Triplex DNA Formation -> Paleček, E. (1991). Local supercoil-stabilized DNA structures . Crit Rev. Biochem. Mol Bfol. 26 , 151 -226. Intramolekulární triplex(formy H, řf*,J DNA může být vytvořen (PuWPy)n sekvencí se zrcadlovou symetrií (tak, aby se mohly vytvořit Hoogstenovy triády bází TAT, O-GC, GGC nebo AAT) -každých 10 bp triplexu relaxuje přibližně 1 nadšroubovicový závit (topologicky přibližně ekvivalentní denaturační bublině) Pozitivní SUperheliCitS je spojena s větším „twistem" dvoušroubovice ■W Znesnadňuje denatliraci DNA (možný smysl pozitivních nadšroubovic u hypertermofilů) ^ znevýhodňuje vznik lokálních otevřených struktur P35= rUŠÍ je (např. křížové formy, které existují v relaxované DNA, zavedením pozitivní superhelicity přejdou do „přímé" B-formy) ALk=-6 ÁWr=6 ATw=0 topoizome: ít \-► ALk=-6 AWr=-3 ATw=-3 ALk=-3 AWr=0 ATw=-3 reverzní gyráza ALk=0 AWr=3 .ATw=-3 vznik křížové formy v křížová forma přetrvává zavedení pozitivních ^ převrácené repetitivm' po relaxaci DNA superhelikálních závitu sekvenci topoizomerázou do „zbytku" molekuly ALk=0 AWr=0 ATw=0 t a t a g a t xxxxxxxx xxxxxxxx t c isr při dostatečně pozitivní ALk může dojít v určitých sekvencích ke vzniku nekomplementární dvoušroubovice (např. z „nepohyblivých", nesymetrických křížových úgek nenf tvořgn komplementární sekvencí=>normálně tato lineární struktura nevznikne xxxxxxxxcct* g a tc a i struktur) xxxxxxxx xxxxxxxx c t Vologodskii, A. V., Yang, X. & Seeman, N. C. (1998). Non-complementary DNA helices structure induced by positive trosional stress. Nucleic A ads Res 2 6, 1503-1508. G a a t ramena (vlásenky) této „nepohyblivé krížové struktury jsou tvořena rôznymi komplementárními sekvencemi, chvbí střed symetrie mcatctag gxxxxxxxx x)000změna hydrodynamických vlastností -to je spojeno s vzájemnou torzní rotací párů bází, zmenší se twist (z obvyklých 36 °) a zvětší počet bp na otáčku cukrfosfát. "Kostra interkalátor v kovalentně uzavřené kružnicové DNA se v důsledku toho zvětší počet nadšroubovicovych závitů (tj. negativně scDNA se relaxuje, relaxovaná přechází na pozitivně sc) =>příprava topoizomerů Wr = 0 Wr>0 7V<0 Wr<0 Detekce lokálních struktur DNA -využití strukturních sond selektivních pro jednořetězcovou DNA -enzymy: si, Pi... -chemikálie reagující s nespárovanými bázemi TG (reaktivita nniH iiii.ii ©so-t J "AaGvůči mimi, J inin BSt^ ~ DEPQ ^SAA karbodiimid I CAA, BAA^^h oso4 —^ n_i T os04 Qř c ^ sterická aábrana v B-DNA B-DNA Nr*\n á^br \C&- ^X^h C.G.O DEPC CAA, BAA karbodiimid ✓ • detekce modifikovaných bazí: -enzymaticky es 1, pd -sekvenacne (charakteristicke obrazce Palecek, E. (1991). Local supercoil- . _ projednotliyj struktury) stabilized dnastructures. r/y* /a?* -specmcke protilatKy Btochem. tioi Biol 26, 151-226. -fyzikalne-chemicke vlastnosti aduktu (elektrochemie, spektxoskopie) Dvojrozmerná (2D) elektrofbréza: detekce strukturních přechodů 1. V prvním směru se rozdělí topoizomery 2. Gel se ekvilibruje v roztoku interkalátoru (chloroquinu) a provede se elektroforéza ve druhém směru -v přítomnosti interkalátoru se DNA odvíjí, tj. snižuje se počet závitů dvoušroubovice=> snižuje se Lko .protože Lk u cccDNA zůstává konstantní, interkalátor sníží negativní a zvýší pozitivní nadšroubovicovou hustotu =>negativní topoizomery se s rostoucí konc. interkalátoru relaxují a přechází do pozitivní nadšroubovice =>tím se zároveň ruší lokální struktury přítomné v negativně superhelikální DNA -nejpomaleji vždy putuje molekula s Wr=0 v nepřítomnosti interkalátoru to je jiný topoizomer než v jeho přítomnosti Bez strukturního přechodu: v 1 -zde se ve druhém směru rozdělily dvojici topoizomerů, které v prvním směru putovaly stejně (pozitivní a negativní o stejné IWrl) -tyto topoizomery nebyly v prvním směru rozlišeny,protože měly příliš vysoké Wr; Se strukturním z přechodemi Tyto dvě molekuly se neliší Wr a putují v gelu téměř stejně; liší se však Lk a Tw (v křížové formě)/\ pXGS40 I chloroquin ^ D2 -** U nflŕml chtaroquina po přidám chloroquinu se v této změní Wr, což se projeví poklesem její pohylivosti v této molekule se pouze „zrušf' křížová forma, tj. změní se celkový Tw, Wr se nezmění; jejich pohyblivost ve druhé směru se bude lišit a objeví se „skok" na obrazci získaném 2D elektroforézou Bowater, R., Aboul-ela, F. & Lilley, 0. M. J. (1992). Two-dimensional gel electrophoresis of circular DNA topoisomers. In Methods inEnzymoIogy{\S\\Vi> D. M. J. & Dahlberg, J. E., eds.); Vol. 212, pp. 105-120. Academic Press, Inc., London. Měření hydrodynamických vlastností DNA -> sedimentační koeficient ->difusní koeficient *r informace o celkovém tvaru molekuly (terciární struktuře), její kompaktnosti sedimentační koeficient 10 kb DNAv závislosti na superhelikální hustotě roste, protože s rostoucí Wr se molekuly stávají kompaktnější větvená plekton nadšroubovice s dalším růstem ALK klesá frekvence větvení, maximum pro bohatě ^že molekuly jsou delší větvené, tudíž velmi =>pokles sedimentačního kompaktní nadšroubovice koeficientu molekuly málo větvené, ale , roste jejich kompaktnost Vologodskli, A. V. & Cozzarelli, N. R C1994). Conformational and Thermodynamic Properties of Supercoiled DNA. Anna Rev. Bfophys, Bfomol Struct.2Z, 609 - 643. Rozptyl světla: -získají se informace o rotačním poloměru molekul DNA -průběh je přibližně zrcadlový k průběhu transportních parametrů 0.00 0.02 0.04 fl.Dfi Cirkulární dichroismus -dvoušroubovicová struktura DNA představuje asymetrické prostředí, které je opticky aktivní => poskytuje CD spektra charakterizovaná molárnf elepticitou e -tato veličina závisí na globální (nebo průměrné) sekundární struktuře DNA, v podstatě na twistu 2 1 -1 CD spektra topoizomerů pBR322 a=-0.07 relaxovaná t * j Relaxing Melting hysteresis ' Elastic modulus of B-form DNA 10 15 20 25 30 ^molekula bez zlomů upevněná za oba řetězce: rotací se v ní indukuje dobře definovaná superhelicita -lze měřit buď .nebo sílu vs. délku při konstantní o délku vs. o při konstantní délce nesymetrické chování superhelikálních molekul: B^při malé síle (napětí) se pozitivní i negativní nadšroubovice chová podobně fl^při velké síle (napětí) podléhá negativní nadšroubovice poměrně snadnému přechodu do „natažené" konformace, zatímco pozitivní nadšroubovice je vůči prodložení rigidní (přechod podobný jako u negativní nadšroubovice je pozorován až při extréme velké síle) 1Ö"p o ' □ a □ □ o" ♦N \ vyšší síly a superhelicita -toto chovám je ve shodě s následujícím vztahy. -symetrie chovám při malém napětí (zkracování molekuly s rostoucí lot při obou znaménkách superhelicity) souvisí se změnami ve „writhu" -vyšší napětí vede ke konverzi AWr na ATw -natažení molekuly vyvolává její odvinutí (srovn. interkalace) - snížení twistu; stejně tak negativní superhelicita; v molekule s konci fixovanými vůči rotaci si oba jevy „pomáhají" (při vyšších o se navíc zřejmě tvoří segmenty levotočivé Z DNA nebo jiné lokální struktury) -zvýšení twistu molekuly má za následek její zkrácení, což přirozeně znesnadňuje její napínání S 0.6 r £ 02 0 o o 0 o o nižší síly a o » superhelicita o o o o o* : + OK 0.8 0.6 0.3 0.1 •0.04 •0.02 0.02 0.04 Strick, T.R. Science 27 1835-7 (1996) Topoizomerázy -enzymy, které mění topologický stav DNA (Lk): regulují superhelikální hustotu DNA (řada procesů - replikace, transkripce, rekombinacě - vede k tvorbě nadšroubovicových závitů a vzájemnému ovíjen molekul DNA, které je potřeba průběžně odstraňovat TOPOIZOMERÁZAMI; jiné děje, např. vytvoření určitých struktur, superhelicitu vyžadují a ta je vytvářena tzv. GYRÁZAMI) -mají schopnost přerušit a znovu spojit řetězec (řetězce) DNA -obecně mají schopnost relaxovat superhelikální DNA spektrum enzymů napříč všemi organismy: dva základní typy: topoizomerázy I během reakce vytvoří a spojí jednořetězcový zlom. topoizomerázy II během reakce vytvoří a spojí dvouřetězcovv zlom. Enzym „protein co" bakteriální topol Int protein Resolváza eukaryotická topo I topoizomeráza III*) reverzní gyráza DNAgyráza Zdroj bakterie E. coli aj. f dg X transpozony eukaryota bakterie (E. coli) termofilnf a hypertermofilní bakterie a Archae RMH Typ (podjednotka) T4 topoizomeráza fdg T4 eukaryotická topo II eukaryota 97 40 21 91 74 128 bakterie (E. coli) 97 + 90 I I i i i i II 58 + 51 + 18 II 174 II Charakteristika Relaxuje pouze negativní nadšroubovici Proteiny zúčastněné v rekombinaci, vykazují topoizomerázovou aktivitu Relaxuje pozitívni i negativní sc Dekatenace Vytváří pozitivní nadšroubovici vyžaduje ATP Vytváří negativní nadšroubovici vyžaduje ATP topoizomeráza IV*) bakterie (E. coli) 67 + 81 II Vyžadují ATP, ale pouze relaxují DNA nevytvářejí nadšroubovici *)toto číselné označeni nemá vztah k počtu přerušených řetězců během reakce!!! Relaxace superhelikální DNA topoizomerázouJy^uJ tyto dvě molekuly mají stejný topologický stav, (vlevo je ALk=Wr=-l a ATw=0; vpravo je molekula s Wr=0, tj. planáraí kružnice, a má ALk=ATw=-l); odvinutí v místě vazby topoizomerázy je naznačeno z ilustrativních důvodů - enzym to takto doslova ve skutečnosti nedělá (potom by y principu nemohl relaxovat pozitivně scDNA; prokaryotické topol však pro první interakci s DNA vyžadují, aby byla „podvinutá", tj. negativně sc) scDNA, 1 negativní závit topoizomeráza se naváže kovalentně v místě, kde je vytvořen jednořetézcovv zlom (obvykle hydroxylovou skupinou tyrozinu na 5' fosfát) -topoizomerázy typu i v principu nevyžadují ATP (fosfodiesterová vyzba není hydrolyzována, ale přenesena na molekulu enzymu) _ skrz zlom je přenesen druhý řetězec; tím dojde ke změně twistu o 1 (směrem k relaxaci) tj. nyní je AWr=0 a ATw=0, => ALk=0 => relaxovaná DNA zlom je znovu spojen a topoizomeráza oddisociuje Další reakce katalyzované topoizomerázami typu I Tvorba jednořetězcových uzlů („knots", „knotting") Tvorba katenanů - jedna z molekul musí obsahovat jednořetězcový zlom; případně tvorba katenanů jednořetězcových molekul Tvorba duplexu ze dvou komplementárních jednořetězcových kovalentně uzavřených cyklických molekul: (tato reakce je vlastně relaxací extrémně negativně superhelikální DNA: výchozí stav topologicky odpovídá superhelikální molekule DNA o Lk=0, tj. ALk=-Lko) Zmény topologického stavu superhelikální DNA topoizomerazouJypdi ALk=Wr=-laATw=0 7 = 16 ft W--2 scDNA, 2 negativní závity topozomeráza se naváže kovalentně v místě, kde je vytvořen dvouřetězcovv zlom hydroxylovou skupinou tyrozinu na 5' fosfáty na obou stranách zlomu) skrz zlom je „provlečena" jiná část molekuly; tím dojde ke změně „writhu" o 2 v tomto případě je.nyní je AWr=0 a ATw=0, => ALk=0 => relaxovaná DNA -za spotřeby ATP gvráza vytváří negativní nadšroubovicové závity u prokaryot: opačný děj (i ty topoizomerázy typu II, které mohou DNA pouze relaxovat, jsou často ATP-dependentaí) zlom je znovu spojen a topoizomeráza oddisociuje Další reakce katalyzované topoizomerázami typu II Tvorba dvouřetězcových uzlů („knots", ,,knotting") Tvorba dvouřetězcových katenanů - molekuly mohou být dvouřetězcové, kovalentně uzavřené Helikázy -rozvíjejí dvoušroubovici: při replikaci, transkripci, rekombinaci, opravných procesech -rozvíjení je spojeno s aktivní translokací podél DNA za spotřeby NTP -dimerní (Rep helikáza) nebo hexamerní struktura (SV 40 T-antigen, DNaB..) Vazba na DNA: -aktivní mechanismus vyžaduje specifické interakce jak s ss, tak ds DNA -u Rep je vazba na ssDNA orientovaná ve smyslu polarity cukrfosfátového řetězce; polarita ss řetězce na rozhraní ss/ds DNA vázaného v P2SD komplexuurčuje směr odvíjení DNA -Rep helikáza v přítomnosti DNA a dimenzuje; může vázat ss a ds DÍJA^v komplexech: v přítomnosti Mg je zvýhodněna struktura P2S, v přítomnosti ADP P2S2 a v přítomnosti nehydrolyzo- vatelných analogů ATP P2SD => viz mechanismus PsP PJn AMPPtNKiPAl*2* Mechanismus odvíjení: i. Rep-helikáza vázaná na rozhraní ss/dsDNA v komplexu p2s2 ii. vazba ATP indukuje uvolnění ssDNA z toho monomeru, který . váže ssDNA proti směru translokace, a výtvorem' komplexu p2sd(iii). translokace rozvíjení ATP \ ADP ♦ H P2S2 I ATP \ — \ P2S 11 P2SD ni P2S2' iv iv. hydrolýza ATP vyvolá konformační změnu, která vede k odvinují DNA a vzniku komplexu p2s2, z něhož oddisociuje ADP (v). (v principu je možný též pasivní mechanismus, kdy helikáza pouze „čeká" na spontánní odpařování nukleotidů mechanismem „dýchání" DNA a vyvažuje ssDNA) -přeměňují chemickou energii ATP na energii mechanickou podobně jako „ motorové" proteiny (myosin, dynein), s nimiž mají některé společné strukturní rysy Součinnost helikáz a topoizomeráz -řada procesů, spojených s rozvíjením DNA, představuje topologický problém, pokud je DNA kovalentně uzavřená kružnice nebo je rozdělena do uzavřených domén; v tom případě rotace odvíjených řetězců indukuje superhelicitu , která musí být relaxována topoizomerázami Z3> -posun replikační vidlice je umožněn tím, že pozitivní superhelicita před vidlicí je relaxována u eukaryot topoizomerázami I a II, u prokaryot gyrázou x$ž~ -segregace replikovaných chromozómů - ty jsou okolo sebe wJ%£ ^. >?omotány"ajsou separovány topoizomerázou II t h hciin "'™ Ortmindina t h -zrušení nukleozomové struktury - vyžaduje zrušení negativní superhelicity, tedy vytvořením pozitivní nadšoubovice. Translokací helikázy podél DNA se vytváří ,za" helikázou negatívni a „preľKJtelikdzou pozitivnínadšroubovice (jako při transkripci). Pozitivní seje absorbována zrusŠníni nukleozomů, negativní topoizomerázou působící za helikázou vxtfívpMQ^^ stejněfunguje archaebakteriální reverzní gyráza Možné „složené enzymy" z helikáz a topoizomeráz: ................ 5 T H H 3T Tn H H i íí „swivekíza" - zde při replikaci - ale může působit i pntraskripci a jako mechanismus umožňující tvorbu nukleozomů (vnáší negativní sc) „segregataza" - topoizomeráza II odstraní vzájemné křížení dceřinných molekul na konci replikace topo I relaxuje negativní sc . za helikázou => reverzní gyráza topo I relaxuje pozitivní sc před helikázou => aktivita / odpovídajícíprokaryotické_ gyrdze 55 yT H „reformatdza" - odstraňuje &||v negativní sc (a tím i otevřené H I JpWBCiokální struktury); rovněž může "^fc1" DNA 23 transkripčním komplexem